Популяция культуры состоит из большого количества клеток, различающихся по биохимической активности. Эти особенности микроорганизмов обусловливают их изменчивость и позволяют получить разнокачественные особи с необходимыми свойствами.
Процесс получения производственных мутантов состоит из двух основных этапов: воздействия на клетки микроорганизмов сильнодействующего мутагенного фактора и последующего отбора высокоактивных вариантов.
В ответ на мутагенное воздействие часть клеток в культуре (популяции) погибает, другие изменяют свои морфологические, культуральные и биохимические свойства, что обусловлено необратимыми изменениями в структуре ДНК клетки.
Различная степень изменчивости микроорганизмов под действием мутагенных факторов ведет к появлению в популяции клеток, различающихся по биохимической активности. Из таких клеток по общепринятой методике выделяют чистые культуры молочнокислых бактерий, изучают биологические свойства и отбирают штаммы, обладающие наиболее выраженными полезными свойствами. В качестве мутагенных факторов применяют физические и химические воздействия.
Из физических факторов наиболее часто используют ультрафиолетовые лучи с длиной волны 2650 нм, которые обладают хорошим мутагенным действием, так как лучи этой длины избирательно поглощаются молекулами ДНК.
При радиационной селекции используют преимущественно гамма-лучи, а также быстрые нейтроны, дающие лучший мутагенный эффект. Однако их использование ввиду небезопасной работы с ними ограниченно.
Химические мутагены дают значительно больше полезных мутаций, чем физические, являясь в то же время менее летальными. В качестве химических мутагенов используют нитрозосоединения, формальдегид, уретан, этиленимин, оксид этилена, диэтилсульфит, диметилсульфит, саркализин и др.
Применяют также сочетание физических и химических факторов. В таких случаях для получения мутантов молочнокислых бактерий чаще используют нитрозосоединения, этиленимин и ультрафиолетовые лучи, гамма-лучи, рентгеновские лучи, быстрые нейтроны.
Метод селекции молочнокислых бактерий воздействием мутагенных факторов является высокоэффективным и доступным для практического использования.
В процессе адаптации микроорганизмов к новым условиям существования они приобретают свойства, не являющиеся наследственно закрепленными. Такие свойства постепенно исчезают, если исчезает фактор, обусловивший их появление. Селекция микроорганизмов адаптацией состоит из двух основных этапов: повышения резистентности культуры и отбора улучшенных вариантов.
Путем адаптации можно повысить устойчивость молочнокислых бактерий к антибиотикам, химическим препаратам, поваренной соли и др. Получены культуры молочнокислых бактерий, резистентные к антибиотикам - низину, пенициллину и стрептомицину. Установлена возможность повышения резистентности культур L. bulgaricum и L. acidkphilum к желчи. Доказана приспособляемость молочнокислых бактерий к повышенной или пониженной температуре развития и высушиванию. Улучшенные формы молочнокислых бактерий, полученные путем адаптации, применяют в производстве кисломолочных продуктов и лечебно-профилактических препаратов.
XI. ПОРОКИ ЗАКВАСОК
В производственных заквасках наиболее часто могут возникать следующие пороки: снижение активности закваски или несквашивание молока, наличие бактерий группы кишечных палочек, излишняя кислотность, вспучивание, ослизнение, тягучесть и др.
Снижение активности закваски является наиболее распространенным пороком заквасок, выражающимся чаще в несквашивании молока. Причинами возникновения порока являются наличие антибиотиков и других ингибиторов в молоке, заражение закваски бактериофагом, низкое содержание сухих веществ в молоке, сезонные изменения качества молока (чаще весной), антагонистические взаимоотношения между микроорганизмами заквасок и др.
Антибиотики в молоко чаще попадают после лечения коров, больных маститами. Режимы пастеризации не вызывают полного разрушения этих препаратов в молоке, поэтому даже очень малые количества антибиотиков отрицательно влияют на рост и активность молочнокислых бактерий и других микроорганизмов заквасок. Причиной снижения активности заквасок может быть загрязнение молока; моюще-дезинфицирующими веществами и другими ингибиторами. При сильном снижении активности закваски, не вызываемом ингибиторами или неправильным культивированием, предполагают наличие бактериофагов, которые попадают в закваску из внешней среды или с заквасочными микроорганизмами в виде лизогенной культуры. ; Для борьбы с распространением бактериофага рекомендуются частая смена закваски, введение в ее состав фагорезистентных штаммов, ; их чередование в закваске, проведение дезинфекции помещения и оборудования, а также поддержание асептического режима выращивания заквасок, применение питательных сред, тормозящих деятельность фагов, и др. В качестве фагорезистентной среды для закваски используют молоко, из которого удален кальций. Последний связывают, добавляя в молоко фосфаты. При отсутствии кальция клетки бактерий и частицы фага, имея одноименный отрицательный заряд, взаимно отталкиваются и фаг не может проникнуть внутрь бактериальной клетки.
Несквашивание молока с пониженным содержанием сухих веществ, а также весеннее несквашивание объясняются пониженной пищевой ценностью молока, а также возможным увеличением в весенний период примеси маститного молока.
Снижение активности закваски может обусловливаться развитием некоторых видов молочнокислых стрептококков, образующих антибиотические вещества, задерживающие рост других заквасочных микроорганизмов.
Наличие бактерий группы кишечных палочек является следствием нарушения установленного режима пастеризации молока, несоблюдения общего санитарного состояния оборудования и личной гигиены.
Излишняя кислотность возникает при развитии термоустойчивых молочнокислых палочек, что обусловлено несоблюдением режима пастеризации молока, неудовлетворительной мойкой и дезинфекцией оборудования, несоблюдением температурных и других технологических режимов.
Вспучивание появляется в основном при развитии спорообразующей микрофлоры, оно обусловлено снижением активности закваски. Для устранения и предупреждения порока необходимы применение активной закваски или смена закваски.
Ослизнение, тягучесть появляются при развитии слизеобразующих штаммов сливочных стрептококков или ацидофильных палочек. Для предупреждения порока необходимо сменить закваску.
XII. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ЗАКВАСОК
Молоко, используемое для приготовления заквасок, должно соответствовать требованиям первого класса по редуктазной пробе, которую производят 2-3 раза в неделю.
Эффективность пастеризации молока для производства заквасок контролируют 1 раз в 10 дней на наличие бактерий группы кишечных палочек. Для этого 10 см3 пастеризованного молока высевают в 40 см3 среды Кесслер и культивируют при 37 °С в течение 24 ч. БГКП не должны выявляться в 10 см3 пастеризованного молока.
Эффективность пастеризации молока проверяют также в том случае, если в стрептококковых заквасках обнаружены палочки.
Для этого асептически отбирают 10 см3 пастеризованного молока и помещают его в стерильную пробирку или колбу. Пробу выдерживают 24-48 ч при 40-45 °С, после чего отмечают характер полученного сгустка и просматривают его микроскопический препарат.
Если пастеризация была проведена при температуре ниже 90 °С, сгусток получается плотным и под микроскопом обнаруживают большое количество стрептококков; при пастеризации 92-95 °С и недостаточной выдержке или без эффективного перемешивания, сгусток в пробирках может быть слабым, микроскопированием выявляют в препаратах зернистые и незернистые палочки.
При правильно проведенной пастеризации (температура 92-95 °С с выдержкой 20-30 мин) в молоке наблюдается пептонизация (отделение сыворотки и наличие зоны просветления в верхнем слое), а при микроскопировании выявляются споровые палочки.
Качество маточной и производственной заквасок на стерилизованном молоке контролируют по активности (предельной кислотности и продолжительности свертывания молока). В случае ее снижения проверяют количество технологической заквасочной микрофлоры и чистоту закваски путем просмотра окрашенного микроскопического препарата не менее чем в 10 полях зрения микроскопа.
Качество производственной закваски на пастеризованном молоке проверяют ежедневно, определяя активность, наличие посторонней микрофлоры путем просмотра микроскопического препарата, содержание БГКП, органолептические свойства сгустка, наличие ацетоина, диацетила, углекислоты и выясняют причины нарушения процесса сквашивания, если таковые имеются.
Контроль кефирных грибковой и культуральной заквасок проводят по кислотности, содержанию БГКП и микроскопическому препарату. При возникновении пороков кефирной закваски проводят дополнительное исследование состава микрофлоры. В кефирных заквасках БГКП должны отсутствовать в 3 см3. Соотношение различных микроорганизмов, входящих в состав кефирных грибковой и культуральной заквасок, примерно одинаковое и составляет в 1 см3: мезофильных молочнокислых стрептококков 108-109; термофильных молочнокислых стрептококков 105-106; ароматобразующих
молочнокислых бактерий 107-108; дрожжей 104-105; уксуснокислых бактерий 103-104.
Активность закваски контролируют по кислотности и продолжительности сквашивания. Производственные закваски для творога, сметаны и обыкновенной простокваши должны иметь кислотность 80-85 °Т; для масла и сыров с низкой температурой второго нагревания -- 90-100 °Т. Кислотность заквасок молочнокислых палочек (сырной, ацидофильной и болгарской) не должна превышать 95-110 °Т, кефирной -- 95-100, закваски для кумыса -- 130-160 °Т.
Продолжительность сквашивания при внесении материнской закваски молочнокислых стрептококков (1-3 %) составляет 6-8 ч, молочнокислых палочек (0,5-1 %) -- 4-6 ч.
Чистоту закваски. а также соотношение между компонентами закваски (например, между молочнокислыми стрептококками и палочками) проверяют ежедневно непосредственным микроскопированием препаратов.
Микроскопические препараты заквасок просматривают в 10 полях зрения. При этом в заквасках, состоящих из молочнокислых стрептококков (для сметаны, творога, простокваши обыкновенной, масла, сыров с низкой температурой второго нагревания), должны обнаруживаться только цепочки кокков и диплококки, равномерно расположенные в поле зрения микроскопа.
В закваске для ряженки, варенца, простокваш мечниковской и южной, йогурта должны присутствовать молочнокислые стрептококки и в меньшем количестве палочки. В закваске для ацидофильной пасты и ацидофильного молока - только палочки.
В кефирной грибковой закваске должны выявляться молочнокислые стрептококки, клетки палочек и дрожжей; в кефирной производственной закваске - молочнокислые стрептококки в преобладающем количестве, единичные палочки и клетки дрожжей.
Рис. Микроскопическая картина заквасок:
а - закваска для творога; 6 - ксфирная закваска; в - закваска для кумыса; г - закваска для южной и мечниковской простокваши; д - производственная ксфирная закваска; е - закваска для ацидофильного молока, дстских ацидофильных смесей
В случае если возникает сомнение в микроскопической чистоте заквасок, а при микроскопировании окрашенных препаратов посторонней микрофлоры обнаружить не удается, из заквасок делают посев нулевого и 4-5 разведений в стерильное обезжиренное молоко. Посевы термостатируют в течение 72 ч. Закваску молочнокислых стрептококков проверяют на наличие посторонних термофильных палочек, поэтому посевы культивируют при 42 °С. Закваски молочнокислых полочек контролируют на присутствие посторонних стрептококков при температуре 30 °С. Из сгустков готовят микроскопические препараты, просматривают их и определяют наличие или отсутствие посторонних микроорганизмов.
Использование этого метода дает возможность установить наличие в закваске посторонней микрофлоры в количестве менее десятков тысяч в 1 см3, которое нельзя обнаружить методом непосредственного микроскопирования.
Посторонняя микрофлора не должна обнаруживаться при посеве 1 см закваски.
Наличие бактерий группы кишечных палочек в закваске определяют посевом ее на среду Кесслер. Закваску предварительно нейтрализуют до рН 7,4-7,6, добавляя к 10 см3 закваски 1 см3 10%-ного раствора питьевой соды. Посевы термостатируют при 37 °С в течение 24 ч. Результаты оценивают по образованию или отсутствию газа в газовке. БГКП должны отсутствовать при посеве 3 см3 закваски для кефира и 10 см3 закваски для остальных продуктов. Анализ на наличие бактерий группы кишечных палочек производят из каждой емкости закваски ежедневно.
Определение наличия диацетила + ацетоина и углекислоты производят в заквасках для масла и сыра.
Содержание диацетила и ацетоина определяют по креатиновой пробе. На белую фарфоровую пластинку наносят в равных объемах (по 1 капле) фильтрат закваски, 40%-ный раствор КОН и 0,04%-ный раствор креатина, тщательно перемешивают.
Отмечают время появления розового окрашивания. Если порозовение произошло менее чем за 7 мин, то закваска считается хорошим продуцентом четырехуглеродных соединений (диацетила + ацетоина). Если же появление розового окрашивания отмечается после 7-10 мин, это указывает на слабую ароматобразующую способность микроорганизмов.
Наличие углекислого газа в закваске устанавливают, наливая в пробирку диаметром 15 мм закваску (20 см ), отмечают ее уровень и ставят на водяную баню с холодной водой. Температуру воды доводят до 90 °С и, не вынимая пробирки, отмечают уровень. Если закваска содержит углекислый газ, то сгусток становится губчатым и поднимается над сывороткой от 0,6 до 5 см и более.
Состав микрофлоры кефирной закваски (производственной и грибковой) определяют методом предельных разведений путем посева различных разведений в стерильное обезжиренное молоко и культивирования их в течение 3 сут. После этого микроскопируют препараты, приготовленные из содержимого пробирок со свернувшимся молоком. На основании полученных результатов составляют числовую характеристику и определяют количество лактококков и лактобактерий по методике, описанной при определении молочнокислых бактерий в молоке.
Ароматобразующие молочнокислые стрептококки выявляют на плотной среде с цитратом кальция при посеве различных разведений закваски. Посевы культивируют при 26 °С в течение 3-5 сут. Затем учитывают колонии, образующие зоны просветления в данной среде.
Дрожжи определяют чашечным методом на сусловом агаре при посеве различных разведений закваски и последующем выращивании при 24 °С в течение 3-5 сут.
Уксуснокислые бактерии определяют методом предельных разведений путем посева разведений в стерильное обезжиренное молоко и термостатирования их при 30 °С в течение 3-5 сут. Учет положительных результатов проводят по желтому кольцу, образующемуся на поверхности свернутого молока.
Требования к закваскам, регламентируемые Санитарными правилами и нормами, представлены в табл.
Наличие бактериофага устанавливают посевом закваски в стерильное обезжиренное молоко с добавлением раствора метиленового синего. Если в процессе культивирования после обесцвечивания метиленового синего через 4-5 ч снова наблюдается посинение молока, это указывает на наличие в закваске бактериофага.
Микробиологические показатели заквасок
Группы заквасок | Масса закваски (см/г), в которой не допускаются | примечание | |||
БГКП (коли-формы) | Патогенные, в том числе сальмоннелы | Staph. fureus | |||
Закваски для кефира (жидкие) | 3,0 | 100,0 | 10,0 | Плесени не более 10 КОЕ/см | |
Закваски для других молочных продуктов, изготовляемых из чистых культур | 10,0 | 100,0 | 10,0 | Плесени и дрожжи не более 10 КОЕ/см | |
Закваски сухие сублимационной сушки, бакконцентраты | 1,0 | 10,0 | 1,0 | То же |
Установление причин нарушения процесса сквашивания. Основными причинами нарушения процесса сквашивания является наличие в молоке ингибирующих веществ или бактериофага.
Для выявления причин несквашивания наблюдают за развитием молочнокислых стрептококков в молоке в первые часы после внесения закваски. Если молоко содержит ингибирующие вещества, развитие микроорганизмов закваски не наблюдается с самого момента заквашивания, если же причиной несквашивания является развитие бактериофага, то сначала наблюдается увеличение количества клеток, а через 2-3 ч - их исчезновение в результате лизиса.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В нашей стране кисломолочные продукты особенно широко стали применять с начала XX в., когда И. И. Мечников впервые изучил значение их в питании человека. Он установил, что молочнокислые бактерии, попадая в кишечник вместе с кисломолочными продуктами, создают кислую среду, препятствующую развитию гнилостных бактерий, которые вызывают распад белков пищи с образованием токсических веществ, отрицательно влияющих на жизнедеятельность макроорганизма. Многие кисломолочные продукты содержат антибиотические вещества, подавляющие развитие кроме нежелательной микрофлоры кишечника также возбудителя туберкулеза, стафилококков и других микроорганизмов. Антибиотические вещества могут образовывать ацидофильная палочка, молочный и сливочный стрептококки, бифидобактерии и др.
Кисломолочные продукты имеют большую ценность с точки зрения физиологии питания. Под действием молочной кислоты казеин молока коагулирует в виде мелких хлопьев и усвояемость кисломолочных продуктов повышается. Так, простокваша в течение 1 ч усваивается организмом человека на 92 %, а цельное молоко -- на 32 %.
В таких кисломолочных продуктах, как кефир и простокваша, содержатся жирорастворимые витамины А, D, Е, которые накапливаются в результате жизнедеятельности бактерий. Творог и кисломолочные напитки богаты солями фосфора, кальция, магния, участвующими в обмене веществ организма человека. Кумыс, кефир, ацидофильно-дрожжевое молоко содержат диоксид углерода и молочную кислоту, следы алкоголя, которые оказывают сильное секреторное воздействие на пищеварительные железы, что улучшает процесс пищеварения и усвоения пищи.
Кисломолочные продукты содержат в достаточном количестве незаменимые легкоусвояемые аминокислоты.
В связи с широким применением антибиотиков в медицине повысилась роль продуктов, содержащих ацидофильные палочки и бифидобактерии. Их использование дает возможность восстановить нормальную микрофлору кишечника, угнетаемую антибиотиками.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Степаненко П. П. Микробиология молока и молочных продуктов.--М.: Лира, 2002.--413с.
2. Банникова Л.А., Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Микробиологические основы молочного производства. - М.: Агропромиздат, 1987. - 400 с.
3. Королева Н.С., Семенихина В.Ф. Санитарная микробиология молока и молочных продуктов. - М.: Пищевая промышленность, 1980. -256 с.
4. Микробиология продуктов животного происхождения /г.-Д. Мюнх, X. Заупе, М. Шрайтер и др./ Пер. с нем. Е.Г. Токаря под ред. д-ра биол наук Н.С. Королевой, канд. биол. Наук Н.В. Билетовой, канд вет наук Р.П. Корнелаевой.- М.: Агропромиздат, 1985. - 591с.
5. Полищук П.К., Дербинова Э.С., Казанцева Н.Н. Лабораторный практикум по микробиологии молока и молочных продуктов. - М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. - 200 с.
6. Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Санитарные правила и нормы (САНПиН 2.3.2.560-96). - М., 1997.
