Активность основных карбоксипептидаз при действии нейролептиков
116
ОГЛАВЛЕНИЕ
- СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- ВВЕДЕНИЕ
- ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1.1. Влияние психолептиков на пептидергические системы
- 1.1.1. Нейропептиды при действии диазепама
- 1.1.2. Нейропептиды при действии галоперидола
- 1.2. Основные карбоксипептидазы и их роль в процессинге регуляторных пептидов
- 1.2.1. Протеолитические ферменты обмена регуляторных пептидов при действии психолептиков
- 1.2.2. Карбоксипептидаза Н
- 1.2.3. Карбоксипептидаза М
- 1.2.4. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза
- ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- 2.1. Материалы исследования
- 2.1.1. Схема эксперимента
- 2.2. Методы исследования
- 2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н
- 2.2.2. Метод определения активности карбоксипептидазы М
- 2.2.3. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
- 2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования
- 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- 3.1. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс в норме и при действии психолептиков
- 3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в тканях интактных крыс
- 3.1.2. Влияние физиологического раствора на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.1.2.1. Влияние однократного введения физиологического раствора на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.1.2.2. Влияние хронического введения физиологического раствора на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.1.3. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс при введении диазепама
- 3.1.3.1. Влияние однократного введения диазепама на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.1.3.2. Влияние хронического введения диазепама на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.1.4. Активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс при введении галоперидола
- 3.1.4.1. Влияние однократного введения галоперидола на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.1.4.2. Влияние хронического введения галоперидола на активность карбоксипептидазы Н в тканях крыс
- 3.2. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях крыс в норме и при действии психолептиков
- 3.2.1. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в тканях интактных крыс
- 3.2.2. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении физиологического раствора
- 3.2.2.1. Влияние однократного введения физраствора на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс
- 3.2.2.2. Влияние хронического введения физиологического раствора на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс
- 3.2.3. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении диазепама
- 3.2.3.1. Влияние однократного введения диазепама на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс
- 3.2.3.2. Влияние хронического введения диазепама на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс
- 3.2.4. Активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс при введении галоперидола
- 3.2.4.1. Влияние однократного введения галоперидола на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс
- 3.2.4.2. Влияние хронического введения галоперидола на активность ФМСФ-ингибируемой КП в тканях крыс
- 3.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс в норме и при введении психолептиков
- 3.3.1. Распределение активности карбоксипептидазы М в тканях интактных животных
- 3.3.2. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении физиологического раствора
- 3.3.2.1. Влияние однократного введения физраствора на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс
- 3.3.2.2. Влияние хронического введения физиологического раствора на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс
- 3.3.3. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении диазепама
- 3.3.3.1. Влияние однократного введения диазепама на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс
- 3.3.3.2. Влияние хронического введения диазепама на активность карбоксипептидазы M в тканях крыс
- 3.3.4. Активность карбоксипептидазы М в тканях крыс при введении галоперидола
- 3.3.4.1. Влияние однократного введения галоперидола на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс
- 3.3.4.2. Влияние хронического введения галоперидола на активность карбоксипептидазы М в тканях крыс
- 3.4. Активность основных карбоксипептидаз in vitro при действии психолептиков
- ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
- ВЫВОДЫ
- ЛИТЕРАТУРА
- СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АКТГ - адренокортикотропный гормон
АПМЯК - аминопропилмеркаптоянтарная кислота
АПФ - ангиотензинпревращающий фермент
БД-рецепторы - бензодиазепиновые рецепторы
ГАМК - г-аминомасляная кислота
ГТ-Рг - гонадотропин-рилизинг гормон
ГПЯК - гуанидинопропилянтарная кислота
ГЭМЯК - гуанидиноэтилмеркаптоянтарная кислота
ДА-рецептор - дофаминовый рецептор
DBI - ингибитор связывания диазепама
ДСИП - дельта-сон индуцирующий пептид
КП - карбоксипептидаза
КПА - карбоксипептидаза А
КПВ - карбоксипептидаза В
КПM - карбоксипептидаза M
КПN - карбоксипептидаза N
КП Н - карбоксипептидаза Н
КРФ - кортикотропин-рилизинг фактор
МСГ - меланоцитстимулирующий гормон
ODN - октадеканейропептид
ПБР - периферический бензодиазепиновый рецептор
ПОМК - проопиомеланокортин
ПХМБ - п-хлормеркурийбензоат
TTN - триаконтатетранейропептид
ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид
ФМСФ-КП - фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбокси-пептидаза
ЭДТА - этилдиаминтетрауксусная кислота
ВВЕДЕНИЕПсихические заболевания занимают в современной медицине довольно обширную нишу болезней человека. Их можно отнести к группе наиболее трудно излечимых. Учитывая высокий риск возникновения психических расстройств, в том числе из-за роста в современном мире различных стрессовых воздействий, экологических факторов, актуальной является проблема профилактики и лечения патологии нервной системы.
В психофармакологии используют препараты, действующие на медиаторные системы [39, 107, 328]. Общепризнано, что галоперидол является анатгонистом дофаминовых, а диазепам - агонистом бензодиазепиновых рецепторов [39, 169, 310]. Однако многообразие фармакологических эффектов этих препаратов трудно объяснить только с этой позиции. В последнее время обсуждается вопрос об участии пептидергической системы в механизмах действия психолептиков [120, 173, 174]. Установлено при этом, что введение галоперидола и диазепама приводит к нарушению баланса ряда пептидов, участвующих в развитии стресс-реакции (АКТГ, энкефалинов, вещества Р) [95, 263], психических болезней (кортикотропин-рилизинг фактора, нейротензина, вещества Р, холецистокинина) и других регуляторных пептидов [164, 193, 228]. Однако механизм влияния психолептиков на уровень биологически активных пептидов до сих пор остается неизученным.
Содержание регуляторных пептидов в организме зависит от соотношения скоростей их синтеза и распада [184, 196]. Нейропептиды синтезируются в виде высокомолекулярных предшественников, которые активируются при ограниченном расщеплении пептид-гидролазами (процессинге) [106, 166, 184, 196, 309]. В конечной стадии процессинга участвуют основные карбоксипептидазы, катализирующие отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца предшественников регуляторных пептидов [9, 26, 147, 311]. Одним из основных ферментов, участвующих в синтезе таких нейропептидов как АКТГ [128, 175], энкефалины [147, 148], вещество P [104], гормон роста [103], пролактин [103] является карбоксипептидаза Н (КФ 3.4.17.10). Известно также, что в обмен энкефалинов и других нейропептидов в организме вовлекается карбоксипептидаза М (КФ 3.4.17.12) [118]. Она участвует в инактивации или модулировании активности пептидных гормонов до или после их взаимодействия с рецепторами [301]. Вместе с тем предполагают, что функции недавно обнаруженной ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы сходны с таковыми КП Н [9, 26]. Однако биологическая роль этого фермента практически остается неясной.
Таким образом, изучение активности КП Н, ФМСФ-КП и КП М в отделах мозга и органах крыс при введении психолептиков может способствовать уточнению биологической роли этих ферментов, а также выяснению молекулярных механизмов взаимодействия дофамин- и ГАМК-ергических систем с пептидергической.
Целью настоящей работы было выяснение роли основных карбоксипептидаз (карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М) в механизмах действия психолептиков на пептидергическую систему.
При выполнении работы были поставлены следующие задачи:
1. Исследование острого введения диазепама и галоперидола на активность карбоксипептидазы Н, фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М в головном мозге, надпочечниках и семенниках крыс через различные промежутки времени.
2. Изучение изменения активности исследуемых карбоксипептидаз в тканях самцов крыс через различные сроки после хронического введения диазепама и галоперидола.
3. Исследование активности карбоксипептидазы Н, ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы и карбоксипептидазы М in vitro при действии аналогичных доз данных препаратов.
Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые изучено влияние галоперидола и диазепама на активность КПН, ФМСФ-КП и КПМ в тканях крыс. Показано, что активность ферментов различным образом изменяется в отделах мозга и органах животных при остром и хроническом введении изучаемых психолептиков. Установлена зависимость изменения активности исследуемых ферментов от времени после введения препаратов.
Полученные результаты представляют интерес для понимания механизмов функционирования пептидергических систем и роли основных карбоксипептидаз в реализации этих механизмов при введении психолептиков. Полученные данные могут быть использованы при разработке фармакологических препаратов для коррекции деятельности пептидергических систем при психических заболеваниях.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на научной конференции Российской Академии Естествознания «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии» (Тунис, июнь, 2005 г.), на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, июнь-июль 2005 г.), на международной конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности центральной нервной системы» (Пенза, сентябрь 2006 г.) и на итоговых научных конференциях ПГПУ (2004, 2005 гг.). По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы по теме диссертации (I глава), материалов и методов исследования (II глава), результатов (III глава), обсуждения (IV глава), выводов. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 19 таблицами и 1 схемой. Список литературы содержит 336 наименований на русском и иностранных языках.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1.1. Влияние психолептиков на пептидергические системы1.1.1. Нейропептиды при действии диазепамаДиазепам (7-хлор-1,3-дигидро-1-метил-5-фенил-2Н-1,4-бензодиазепин-2-он) является классическим транквилизатором, который проявляет анксиолитический, седативный, снотворный, миорелаксирующий, противосудорожный и другие эффекты [39]. Бензодиазепины были введены в клиническую практику около 40 лет назад и до сих пор находят широкое применение [52]. В 1977 г. было обнаружено, что бензодиазепины взаимодействуют с безодиазепиновыми рецепторами, которые, как оказалось, были неотъемлемой частью ГАМКA-рецептора [163]. Комплекс рецептора был изолирован и секвенирован в 1987 г. [249].
Наибольшая плотность бензодиазепиновых рецепторов обнаружена в коре больших полушарий, затем в гиппокампе, мозжечке, гипоталамусе, стриатуме, среднем мозге [40, 218, 222]. По ряду фармакологических и биохимических свойств бензодиазепиновые рецепторы можно разделить на центральные и периферические: центральные найдены только в головном мозге, а периферические - как в мозге, так и в других органах [40, 152, 276]. Наибольшая плотность периферических бензодиазепиновых рецепторов обнаружена в коре надпочечников [40]. Согласно результатам опытов in vitro периферические бензодиазепиновые рецепторы, в отличие от центральных, не связаны с ГАМК-рецепторами [267].
В головном мозге бензодиазепиновые рецепторы локализованы на постсинаптических мембранах ГАМК-ергических систем и входят в состав ГАМКА-бензодиазепин-ионофорного комплекса, состоящего из трех компонентов: бензодиазепинового рецептора, ГАМК-рецептора и хлорного канала [267, 325]. Работа всего комплекса направлена на открывание хлорных каналов, опосредуемое ГАМК-рецептором. Классические бензодиазепины в клиническом использовании увеличивают эффективность ГАМК, понижая концентрацию, необходимую для открытия канала.
ГАМКА-бензодиазепиновый рецептор состоит из пяти белковых субъединиц, расположенных подобно розетке вокруг центрального канала и пронизывающих мембрану клетки, непроницаемую для Cl--ионов [249]. Анализ литературных данных [74, 121, 249] показывает, что активная форма ГАМКА-бензодиазепинового рецептора представлена двумя б-субъединицами, двумя в-субъединицами и одной г-субъединицей. Полагают, что б-субъединица связывает бензодиазепины, а в-субъединица - ГАМК [121, 249]. г-субъединица, по-видимому, не связывает бензодиазепины и ГАМК, но она может оказывать влияние на способность б- и в-субъединиц к рецепции «своих» лигандов. Таким образом, ГАМК, связываясь с в-субъединицей, вызывает конформационные изменения белков ионофорного канала, приводящие к усилению тока Cl-. Алостерическая модуляция этих изменений обусловлена связыванием лигандов с б-субъединицей рецептора [74, 249].
Наличие на синаптических мембранах нервных клеток высокоаффинных мест связывания для бензодиазепинов свидетельствовало о существовании эндогенного лиганда этих рецепторов. Costa с сотрудниками выделили сначала из мозга крысы, а затем и человека белок, способный ингибировать связывание [3Н]-диазепама с синаптическими мембранами [112, 133]. Было определено, что эндогенный лиганд представляет собой полипептид с Mr 9000, который был назван DBI - ингибитор связывания диазепама (англ. diazepam binding inhibitor). В структуре DBI преобладают основные аминокислоты, N-конец пептида защищен; С-конец определяет биологическую активность при взаимодействии пептида с рецептором [77]. DBI является предшественником ряда биологически активных пептидов, главные из которых DBI 33-50, или октадеканейропептид (ODN), DBI 17-50, или триаконтатетранейропептид (TTN) и DBI 26-50, или эйкозапентанейропептид (EPN). Все эти пептиды содержат одинаковую последовательность на С-конце: Глн-Ала-Тре-Вал-Гли-Асп-Вал-Асн-Тре-Асп-Арг-Про-Гли-Лей-Лей-Асп-Лей-Лиз [112]. DBI и его фрагменты объединяют термином эндозепины. Они являются негативными аллостерическими модуляторами ГАМКА-рецептора, снижающими эффективность взаимодействия ГАМК с рецептором [8, 112], и относятся к анксиогенным соединениям, усиливающим состояние тревоги, страха и «проконфликтные» ответы в тесте Фогеля [8, 152].
Эндозепины найдены в тканях человека, крысы, свиньи, быка, лягушки Rana ridibunda, форели [209, 264, 320]. Имунногисто-химическое картирование мозга крысы показало наибольшие концентрации DBI (10 - 50 мМ) в коре больших полушарий, гиппокампе, мозжечке, гипоталамусе, миндалине [72, 113]. У человека самые высокие концентрации были найдены в мозжечке, миндалине, гиппокампе, гипоталамусе и черном веществе, а также в спинном мозге и спинномозговой жидкости [133]. На клеточном уровне, DBI был обнаружен в нейронах и клетках глии, тогда как ODN и TTN были главным образом найдены в нейронах [61, 113, 320]. Наиболее высокие уровни мРНК DBI были найдены в мозжечке и эпендиме третьего желудочка мозга крысы, промежуточные уровни - в обонятельной луковице, дугообразном ядре, эпифизе и гипофизе [62].
С помощью электронной микроскопии показано присутствие ODN в перикарионе нейронов, эндоплазматическом ретикулуме, аппарате Гольджи, микротрубочках, свободных рибосомах [61]. В окончании нейронов DBI и ODN накапливаются в синаптических везикулах [61, 132]. При деполяризации синаптических окончаний под действием К+ одновременно с DBI высвобождаются ГАМК и энкефалины, что указывает на их сосуществование в одном пресинаптическом окончании. К+-стимулируемый выброс DBI зависит от присутствия Са2+ [132].
Есть данные, согласно которым эндозепины влияют на рост клеток глии через аутокринные механизмы [149]. Низкие концентрации ODN (10-10-10-14М) in vitro стимулировали синтез ДНК в глиальных клетках крысы, действуя через центральный тип бензодиазепиновых рецепторов.
DBI и его производные широко распространены в тканях, содержащих периферические бензодиазепиновые рецепторы и участвующие в липидном обмене [55, 88, 108, 128]. Наибольшая концентрация эндозепинов обнаружена в клетках надпочечников, печени, семенников, почек [63, 72, 113]. Количество ODN в этих тканях составляет 400-800 пмоль/г сырой массы [8]. Кроме того, эндозепины обнаружены в клетках Шванна [63]. Присутствие мРНК DBI в периферических органах крысы [62, 91] и человека [252] позволяет заключить, что эндозепины синтезируются и в периферических тканях. Здесь DBI выполняет иные функции, чем в нейронах: он не высвобождается из срезов периферических органов при деполяризации [132]. Через рецепторы, расположенные на мембране митохондрий, эндозепины могут осуществлять регуляцию внутриклеточного метаболизма [96, 124]. В частности, DBI транспортирует холестерол к внутренней мембране митохондрий [113]. Взаимодействие DBI с периферические бензодиазепиновыми рецепторами усиливает вход холестерола в митохондрии с последующим усилением синтеза предшественника стероидов прегненолона. Этот процесс наблюдается как в клетках коры надпочечников [96, 113, 131], так и в глиальных клетках мозга [113, 124]. В надпочечниках это АКТГ-зависимый процесс. Идентичность DBI и белка, связывающего ацил-коэнзим А, выделенного из ткани печени [100, 113], указывает на способность DBI опосредовать синтез жирных кислот. Таким образом, DBI играет существенную роль в синтезе стероидных гормонов в различных тканях за счет регуляции лимитирующей стадии [202].
Уровень DBI в надпочечниках зависит от уровня АКТГ в организме. Удаление гипофиза у крыс вызвало уменьшение концентрации DBI и ПБР в надпочечниках, введение АКТГ уменьшило этот эффект, то есть существует положительная корреляция между уровнем DBI и ПБР в надпочечниках и уровнем кортикостерона в плазме крови [96, 131]. Возможно, что de novo синтез DBI в надпочечниках является важным фактором, опосредующим АКТГ-зависимый стероидогенез.
Страницы: 1, 2