2.2.1. Метод введения половых стероидных гормонов
При изучении влияния половых гормонов на КП Н и ФМСФ-ингибируемую карбоксипептидазу in vivo все препараты вводились внутрибрюшинно в виде растворов в оливковом масле. Вводимый объем был равен 0,1 мл. Дозы половых гормонов были следующими: 1) 3 и 30 мг на кг массы в случае пропионата тестостерона; 2) 1 и 10 мг на кг массы в случае прогестерона. Контрольным животным вводили равный объем оливкового масла. В работе использовали следующие группы животных.
Группа | Пол | Вводимое вещество | Доза | |
1 | Самки | Пропионат тестостерона | 3 мг на кг массы тела | |
2 | Самцы | Пропионат тестостерона | 3 мг на кг массы тела | |
3 | Самки | Пропионат тестостерона | 30 мг на кг массы тела | |
4 | Самки | Прогестерон | 1 мг на кг массы тела | |
5 | Самцы | Прогестерон | 1 мг на кг массы тела | |
6 | Самки | Прогестерон | 10 мг на кг массы тела | |
7 | Самцы | Оливковое масло | - | |
8 | Самки | Оливковое масло | - | |
9 | Самцы | - | - | |
10 | Самки | - | - |
Животных декапитировали через 0,5, 4 и 24 часа после инъекции. Затем извлекали головной мозг, половые железы, надпочечники и помещали их в охлажденный до 4оС физиологический раствор (0,9% раствор хлорида натрия в воде). Все дальнейшие процедуры, если не оговорено иначе, проводили при 4оС.
Головной мозг тщательно очищали от оболочек, кровеносных сосудов и извлекали гипофиз и гипоталaмус.
Яичники и надпочечники тщательно очищали от жира.
Образцы тканей хранили при температуре -20оС не более одного месяца до использования.
Для исследования влияния половых гормонов на КП Н и ФМСФ-ингибируемую карбоксипептидазу in vitro гомогенаты тканей инкубировали с гормонами или оливковым маслом в течение 60 мин при 4оС. Концентрации гормонов соответствовали дозам при введении in vivo. Затем определяли активность ферментов как описано ниже.
Для определения активности ферментов образцы тканей взвешивали, а затем гомогенизировали в 50 мМ натрий-ацетатном буфере (pH 5,6), содержащем 50 мМ хлорида натрия в соотношении 1:400 (вес:объем).
2.2.1. Метод определения активности карбоксипептидазы Н
Активность КП Н определяли флюорометрическим методом по Supattapone S., Fricker L.D., Snyder S.H. [262].
Для определения активности фермента смешивали 150 мкл (в случае контрольной пробы) или 140 мкл (в случае опытной пробы) вышеуказанного буфера с 50 мкл гомогената ткани. Опытные пробы содержали 1 мкМ ГЭМЯК. Пробы преинкубировались 8 мин при 37оС.
Реакцию начинали прибавлением 50 мкл 210 мкМ дансил-Phe-Ala-Arg на 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,6 (конечная концентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ). Далее пробы инкубировали 60 мин при 37оС. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты. Для экстракции продукта реакции - дансил-Phe-Ala - к пробам приливали 1,5 мл хлороформа и встряхивали в течение 60 сек. Для разделения фаз пробы центрифугировали 5 мин при 1000 g. Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 в кювете толщиной 1 см при ex=360 нм и em=530 нм. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-Phe-Ala в хлороформе.
Активность КП Н определяли как разность в накоплении продукта реакции в пробах, несодержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-Phe-Ala образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.2. Метод определения активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы
Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы определяли флюориметрическим методом [7, 11]. К 150 мкл, в случае контрольной пробы, и к 140 мкл, в случае опытной пробы, вышеуказанного буфера прибавляли по 50 мкл гомогената.
В опытную пробу добавляли 10 мкл 25 мМ раствора ФМСФ, приготовленного на этиловом спирте (конечная концентрация ФМСФ в реакционной смеси составляла 1 мМ).
Дальнейшее определение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы проводилось так же, как и для КП Н, с той лишь разницей, что вместо дансил-Phe-Ala-Arg в качестве субстрата использовали 50 мкл 210 мкМ дансил-Phe-Leu-Arg на 50 мМ натрий-ацетатном буфере, pH 5,6.
Активность фермента определяли как разность в накоплении продукта дансил-Phe-Leu в пробах, несодержащих и содержащих ФМСФ. Активность выражали в нмоль дансил-Phe-Leu образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
2.2.3. Метод определения концентрации белка
Количество белка в пробах определяли по методу Lowry и соавт. [179].
2.2.4. Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента [31]. Корреляционный и дисперсионный анализы проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation, One-Way ANOVA и Multifactor ANOVA. Принадлежность подгрупп животных к разным гомогенным группам оценивали с помощью Multiple range analysis (Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США)). Принадлежность экспериментальных (временных) подгрупп к разным гомогенным группам проводили только в случае достоверности критерия Фишера. При этом оценивали количество гомогенных групп, образуемых экспериментальными подгруппами, с уровнем достоверности р<0,05. Баллы подгруппам присваивали на основании их принадлежности к разным гомогенным группам по мере увеличения среднего. При этом минимальный балл получала временная подгруппа с минимальным средним, максимальный балл - временная подгруппа с максимальным средним, а дробный балл (1,5) получали подгруппы, входящие одновременно в две гомогенные группы. На основании присвоеных баллов судили о динамике изменения активности ферментов.
ГЛАВА 3. Результаты исследования
3.1. Тканевое распределение активности основных карбоксипептидаз у самцов и самок мышей
3.1.1. Распределение активности карбоксипептидазы Н в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей
Полученные данные о распределении активности КП Н в ГГНГС самцов и самок мышей представлены в таблице 3.1.1.
Таблица 3.1.1. Распределение активности (нмоль дансил-Phe-Ala в мин на мг белка) КП Н у самцов и самок мышей (n=58).
Пол животного | Отдел ГГНГС, M±m | ||||
Гипофиз | Гипоталамус | Надпочечники | Половые железы | ||
Самцы | 1,41±0,10 | 0,78±0,02 | 0,16±0,04 | 0,10±0,02 | |
Самки | 4,63±0,63 | 1,88±0,29 | 0,54±0,08 | 0,40±0,08 |
Максимальная активность фермента у самцов обнаружена в гипофизе. В гипоталамусе активность была примерно в 2 раза ниже, а в надпочечниках и семенниках - в 9-15 раз ниже, чем в гипофизе.
У самок в порядке снижения активности КП Н ткани можно расположить следующим образом: гипофиз (максимальная активность), гипоталамус (активность, примерно, в 2,5 раза ниже), надпочечники, яичники (минимальная активность). Таким образом, распределение активности КП Н в ГГНГС мышей сходно с таковым у других видов животных [12, 44, 117, 122, 165, 182, 256, 262]. Однако обнаружены некоторые отличия между распределением активности КП Н у мышей разного пола. У самцов разница между активностью этого фермента в надпочечниках и таковой в гонадах составляет, примерно, 67%, а у самок - только 35%. У самок активность КП Н, в целом, примерно в 3,3 раза выше, чем у самцов.
3.1.2. Распределение активности ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системе самцов и самок мышей
Полученные данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП у самцов и самок мышей представлены в таблице 3.1.2.
Таблица 3.1.2. Распределение активности (нмоль дансил-Phe-Leu в мин на мг белка) ФМСФ-ингибируемой КП у самцов и самок мышей (n=58).
Пол животного | Отдел ГГНГС, M±m | ||||
Гипофиз | Гипоталамус | Надпочечники | Половые железы | ||
Самцы | 0,75±0,08 | 0,30±0,01 | 1,51±0,12 | 0,66±0,04 | |
Самки | 2,69±0,11 | 1,63±0,09 | 6,72±0,46 | 7,93±0,56 |
У самцов максимальная активность исследуемого фермента обнаружена в надпочечниках. В гипофизе и семенниках активность ФМСФ-ингибируемой КП примерно в 2 раза, а в гипоталамусе - в 5 раз ниже, чем в надпочечниках.
У самок распределение активности этого фермента несколько отличается от такового у самцов. Наивысшие показатели активности были отмечены в яичниках и надпочечниках (в последних на 15% ниже, чем в первых). Минимальная активность ФМСФ-ингибируемой КП, также как и у самцов, обнаружена в гипоталамусе.
Таким образом, как у самцов, так и у самок, наиболее высокие показатели активности ФМСФ-ингибируемой КП в ГГНГС обнаружены в надпочечниках и половых железах - основных источниках половых стероидов в организме. У самцов активность ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках на 127% выше, чем в семенниках; у самок в надпочечниках - на 15% ниже, чем в яичниках. У самок активность ФМСФ-ингибируемой КП в гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системе примерно в 4,5 раза выше, чем у самцов.
Следует также отметить, что распределение активности ФМСФ-ингибируемой КП в тканях мышей сходно с таковым у других видов животных [8, 13, 12, 44, 45].
Таким образом, сравнивая распределение активности двух основных карбоксипептидаз в ГГНГС, можно заключить, что если активность КП Н и у самцов, и у самок, максимальна в гипофизе и гипоталамусе, то активность ФМСФ-ингибируемой КП - в надпочечниках и половых железах. Возможно, это связано с разной функциональной ролью данных ферментов в различных отделах ГГНС и ГГГС.
3.2. Активность основных карбоксипептидаз у самок мышей при введении тестостерона и прогестерона
Известно, что тестостерон и прогестерон оказывают влияние на уровень различных пептидных нейрогормонов в организме животных [67, 167, 175, 213, 214, 245, 266, 274], а также на активность некоторых протеолитических ферментов [24, 67, 127, 191] . В связи с этим представляет интерес изучение влияния данных половых стероидов на активность ферментов обмена нейропептидов: КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП.
3.2.1. Активность карбоксипетидазы Н и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы при введении тестостерона в тканях самок мышей
Активность КП Н в гипофизе через 0,5 ч после введения тестостерона в дозе 3 мг на кг массы была выше на 61%, по сравнению с контрольной группой животных (рис. 3.2.1). Через 24 ч после введения тестостерона активность исследуемого фермента в гипофизе была на 16%, а в гипоталамусе и надпочечниках - на 45-50% ниже, чем у контрольных животных. В яичниках достоверных изменений активности КП Н не обнаружено. Снижение активности фермента в гипофизе и гипоталамусе через 24 ч после инъекции тестостерона в дозе 3 мг на кг массы может быть связано с тем, что экзогенный тестостерон подавляет выработку эндогенного тестостерона по механизму обратной связи посредством снижения уровня синтеза и секреции ЛГ и гонадотропин-рилизинг фактора [202]. Период полужизни экзогенного тестостерона составляет 40-100 мин [42, 192], то есть через 24 ч после введения экзогенный тестостерон полностью элиминируется, тогда как выработка эндогенного еще может быть подавлена. Это, вероятно, может приводить к снижению биосинтеза нейропептидов и к снижению активности КП H.
Активность КП Н у самок, которым вводили тестостерон в дозе 30 мг на кг массы, была ниже таковой у контрольных мышей в гипофизе и надпочечниках через 24 ч - на 29% и 55% соответственно (рис. 3.2.2). Через 0,5 и 4 ч после инъекции тестостерона в этих органах достоверных изменений активности КП Н не выявлено. В гипоталамусе активность этого фермента изменялась волнообразно: через 0,5 ч после введения активность была ниже на 36%, через 4 ч - на 22% выше, а через 24 ч - вновь ниже на 53%, по сравнению с контрольными животными. Только в этом отделе ГГНГС отмечено достоверное отличие во влиянии разных доз тестостерона. В яичниках активность КП Н достоверно не изменялась при введении тестостерона в дозе 30 мг на кг массы.
Для более полного понимания характера выявленных изменений активности основных карбоксипептидаз первичный экспериментальный материал бы подвергнут дисперсионному анализу влияния времени после инъекции при введении различных доз тестостерона (таблицы 3.2.1.1. и 3.2.1.2).
Статистически значимая динамика активности КП Н наблюдается только в гипоталамусе в случае введения тестостерона в дозе 30 мг на кг массы (таблица 3.2.1.2).
Дисперсионный анализ влияния времени и дозы гормона (таблица 3.2.1.3) показал отсутствие достоверной зависимости активности КП Н от дозы экзогенного тестостерона в исследованном диапазоне доз. Только в гипоталамусе обнаружено влияние взаимодействия времени после инъекции и дозы вводимого гормона на активность исследуемого фермента.
Таким образом, при введении различных доз тестостерона существенных отличий в активности КП Н у самок не обнаружено.
В гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП после введения тестостерона (доза 3 мг на кг массы) через 0,5, 4 и 24 ч была ниже соответственно на 28, 61 и 59%, по сравнению с контролем (рис. 3.2.3). В гипоталамусе через 0,5 ч после введения активность исследуемого фермента не изменялась, а через 4 и 24 ч была на 35-40% ниже, чем у контрольных животных. В надпочечниках изменения в активности ФМСФ-ингибируемой КП отмечены только через 24 ч: повышение на 14% по сравнению с контрольными самками. В яичниках активность фермента через 0,5 и 24 ч была соответственно на 21 и 49% ниже, по сравнению с контролем.
Влияние тестостерона в дозе 30 мг на кг массы, в целом, сходно с таковым в дозе 3 мг на кг массы (рис. 3.2.4). При этом в гипофизе активность ФМСФ-ингибируемой КП во все исследуемые временные интервалы была ниже, по отношению к контрольным самкам (через 0,5 ч - на 39%, через 4 и 24 ч - на 62-68%). В гипоталамусе через 0,5 ч после инъекции активность этого фермента не отличалась от таковой у контрольных животных, а через 4 и 24 ч - была ниже на 35-40%. В надпочечниках изменений активности ФМСФ-ингибируемой КП не обнаружено. В яичниках достоверное изменение активности отмечено только через 24 ч послее введения тестостерона в дозе 30 мг на кг массы: снижение на 30% по отношению к контролю.
Дисперсионный анализ влияния времени после инъекции при введении различных доз тестостерона на активность ФМСФ-ингибируемой КП (таблицы 3.2.1.1. и 3.2.1.2) показал, что статистически значимая динамика изменения активности фермента наблюдается в гипофизе, гипоталамусе и яичниках. Причем динамика изменений активности фермента в этих отделах ГГНГС одинаковая - повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП к 0,5 ч и снижение к 4 ч. В интервале 4-24 ч активность ФМСФ-ингибируемой КП статистически достоверно не изменялась.
Дисперсионный анализ влияния времени и дозы гормона (таблица 3.2.1.3) показал отсутствие зависимости активности ФМСФ-ингибируемой КП от дозы экзогенного тестостерона в исследованном диапозоне доз, а также от взаимодействия дозы и времени после введения.
Таким образом, как и в случае с КП Н, не обнаружено существенных отличий во влиянии различных доз тестостерона (3 и 30 мг на кг массы) на активность ФМСФ-ингибируемой КП.
Известно, что in vitro тестостерон в концентрации 0,01 и 0,1 мкг на мл увеличивает секрецию окситоцина клетками гранулезы яичников на 75 и 100% соответственно. Более высокая концентрация (10 мкг на мл) - ингибирует на 66% [274]. Таким образом, отличия в действии проявляются при разнице между дозами в 100-1000 раз. С другой стороны, дозы тестостерона, различающиеся в 5 раз (5 и 25 мкг), одинаково влияли на индекс веса тимуса у новорожденных самок мышей [110]. В настоящем исследовании дозы отличались между собой в 10 раз. Возможно, именно поэтому существенных отличий в изменении активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП при введении тестостерона не выявлено.
В изменении активности КП Н и ФМСФ-ингибируемой КП обнаружены некоторые отличия при действии тестостерона в дозе 3 мг на кг массы. В гипофизе через 0,5 ч после инъекции мужского полового гормона активность КП Н возрастала, а активность ФМСФ-ингибируемой КП, наоборот, снижалась. С другой стороны, через 24 ч после введения в надпочечниках активность ФМСФ-ингибируемой КП повышалась, а КП Н - снижалась. Поскольку КП Н и ФМСФ-ингибируемая КП отличаются субстратной специфичностью [11, 147, 148], то возможно, подобное различие в изменении активности связано с участием исследуемых карбоксипептидаз в процессинге разных биологически активных пептидов, уровень которых в гипофизе и надпочечниках по-разному изменяется при введении тестостерона или прогестерона.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
