Отличия деградации лигнина от деградации других полимеров заключается в том, что такие полимеры, как протеины, полисахариды, нуклеиновые кислоты, состоят из регулярно повторяющихся единиц, в то время как лигнин состоит из различных мономеров, имеющих различные типы связей. Большинство микроорганизмов, воздействующих на лигнин, вызывают в нем очень незначительные изменения, которые проявляются в основном в уменьшении числа метоксильных групп и очень слабой потере в весе. Некоторые сумчатые и несовершенные грибы могут расти на средах, содержащих препарат лигнина в качестве единственного источника углерода, такие, как Fusarium lactis, F. nivale и некоторые другие, но они не вызывают существенных изменений в молекуле лигнина. Вещества, представляющие собой производные лигнина, - ванилин, сиреневый альдегид и другие, используются грибами родов Chaetomella, Coniothyrium, Cylindrocarpon, Torula, Hormiscium.
Исследования последних лет показывают, что полное разложение лигнина с разрушением ароматического кольца могут осуществлять только базидиальные древоразрушающие грибы, вызывающие белую гниль: Coriolus versicolor, Fomes fomentarius, и некоторые подстилочные базидиомицеты, такие, как виды родов Collybria, Marasmius, Mycena.
Высокая молекулярная масса и низкая растворимость лигнина препятствуют его прямой ассимиляции микроорганизмами. Предварительно происходит его расщепление экзоферментами во внешней среде. Своеобразное химическое строение лигнина делает его труднодоступным для ферментных систем микроорганизмов. Многие микроорганизмы обладают ферментными системами, способными к превращению простых ароматических соединений. Однако полизамещенные ароматические соединения - мономеры лигнина - доступны лишь немногим представителям отдельных родов, так как для их разложения требуются весьма редкие у микроорганизмов ферменты деметилирования и декарбоксилирования ароматических структур. Необычен для микроорганизмов и характер связей между мономерами, некоторые из них не имеют аналогий среди соединений, типичных для живой клетки. Они совершенно недоступны для ферментов - деполимераз микроорганизмов, легко разрушающих белковые, полисахаридные, полинуклеиновые молекулы.
Способность многих грибов разлагать клетчатку и лигнин определяет их активное участие в разложении растительного опада. В растительном опаде в древесине лигнин и целлюлоза образуют природный комплекс, в котором его составляющие структурно и химически связаны между собой. Разложение лигноцеллюлозного комплекса грибами установлено серией экспериментов по разложению растительного опада, проведенных В.Я. Частухиным. Он разработал специальную методику для лабораторного изучения процессов распада, которая позволила создать модель процессов, происходящих в природе, в условиях точно контролируемых опытов.
По характеру воздействия на опад выделяют три группы подстилочных сапротрофов (Мирчинк, 1988):
I группа - грибы, преимущественно разлагающие клетчатку, - Lepiota procera.
II группа - грибы, преимущественно разлагающие лигнин, - Phallus impudicus.
III группа - грибы, осуществляющие смешанное воздействие, - Collybria, Marasmius, Clitocybe.
Г. Линдбергом были проведены опыты по определению интенсивности разложения целлюлозы и лигнина подстилочными сапротрофами, принадлежащими к различным видам Marasmius, непосредственно в растительном опаде с точным учетом исходного и конечного содержания этих продуктов в субстрате. Почти все виды Marasmius оказались способными разлагать лигнин, но интенсивность разложения лигнина у разных видов различна. Также было различным отношение количеств разложенных лигнина и клетчатки. Таким образом, внутри рода Marasmius можно выделить группы, преимущественно разлагающие лигнин, клетчатку или оба компонента вместе (Мирчинк, 1988).
1.2.6 Разрушение грибами древесины
Различные грибы разрушают мертвую древесину живых деревьев, проникая в центральный цилиндр чаще всего через поражения коры. Другие виды заселяют преимущественно заготовленную древесину, а некоторые даже специализируются на деревянных постройках. Повреждения ими отрицательно влияют на прочность (важную в строительстве) и внешний вид (фанеровка) материала.
Как субстрат древесина содержит лишь следы доступных питательных веществ. Разложение клеточных стенок требует особых ферментов. Недостаток кислорода, высокое содержание двуокиси углерода, неизбежно образуемой организмами во время роста, а также низкая влажность среды осуществляют дальнейший жесткий отбор соответствующих грибов, из которых большинство относится к базидиомицетам; на древесине встречаются и аскомицеты, в том числе вызывающие ее окрашивание.
Большой практический интерес вызывают в настоящее время грибы, разрушающие лигнин, лигноцеллюлозу и целлюлозу; наряду с этим повреждения грибами древесины всегда требовали огромного внимания. Профилактические меры принимаются на всех этапах ее заготовки: рубка в холодное время, ускоренная распиловка на бревна и доски, предпочтение пород с твердой более устойчивой к грибам древесиной, аэрируемое хранение при максимальном снижении контакта пиломатериалов с почвой и друг с другом в штабелях. Древесину, которая будет подвергаться воздействию неблагоприятных погодных условий, особым образом пропитывают, а в строительном деле часто дополнительно защищают путем покраски, обжигания или лакировки (Мюллер, 1995).
Участвуя в разложении многих углеродсодержащих веществ растительного опада и древесины в первую очередь трудноразлагаемых полимерных соединений, где грибам принадлежит ведущая роль, они занимают значительное место в круговороте углерода, являясь поставщиками СО2 в атмосферу.
Среди грибов есть организмы, разлагающие жиры и воска, входящие в состав растительных и животных тканей. Это определяется наличием у них ферментов липаз. Наибольшей активностью липолитических ферментов обладают виды Mucor lipolyticus, Rhizopus nigricans, Aspergillus niger, Penicillium verrusum, Penicillium roquefortii. Многие выделены с поверхности растений, являясь эпифитами и способны разлагать также восковые налеты на поверхности растений.
Известна также способность грибов разлагать как алифатические, так и ароматические углеводороды. В этом отношении наибольшей активностью характеризуются грибы рода Aspergillus (Мирчинк, 1988).
1.2.7 Разрушение грибами текстиля и сходных изделий
Шерсть, лен, хлопок, кожа, как и практически все прочие материалы растительного и животного происхождения, могут ферментативно разрушаться грибами. Чаше всего это аскомицет Chaetomium globosum (Sphaeriales), Myrothecium, Trichoderma и многие другие Fungi imperfecti (Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Stemphylium, Gliocladium, Cladosporium). Наиболее важны здесь обладающие высокой ферментативной активностью, быстрорастущие убиквисты, тогда как специализированные Basidiomycota преобладают лишь в особо благоприятных для них условиях.
Для своего роста и разрушающего действия эти неприхотливые грибы нуждаются в минимуме влажности. Если такое условие выполнено, они заполняют также бумагу, веревки и сходные материалы, бедные питательными веществами.
При разложении природных макромолекул грибы предпочтительны из-за высокой ферментативной активности; к тому же их целлюлазы и другие ферменты чаще, чем у бактерий, выделяются из клеток.
Эти свойства грибов можно использовать при получении «биогаза» на предварительной стадии разрушения полимеров и для рециклизации отходов - бытового мусора (Мюллер, 1995).
1.2.8 Разрушение грибами нефтепродуктов
В последние десятилетия в связи с возродившимся интересом к процессам микробного превращения углеводородов были обнаружены мицелиальные грибы, деятельность которых приводит к деструкции нефти и ее производных. В настоящее время доказано, что утилизировать нефтепродукты, в том числе различные топлива, во время хранения и транспортировки способны многие виды грибов и бактерий (Андреюк, 1980).
Нефтепродукты как среда обитания грибов характеризуются рядом особенностей: 1) содержат большое количество сравнительно доступного углерода и минимальное - азота при почти недоступном пространственном расположении его в молекуле; 2) в них почти отсутствует доступная активная вода. Это оказывает существенное влияние на синтез de novo грибной клетки.
Вопросы необходимого соотношения C:N у грибов при росте на нефтепродуктах в биохимическом аспекте исследованы еще мало и уровень этих данных уже не отвечает современным представлениям о возможностях грибной клетки. Очевидно, здесь имеет место не только типичный гетеротрофный процесс, но также определенное подобие хемотрофии и автотрофии, причем стадии роста отличаются и специфичны по способности к разным типам трофики. Особенно это проявляется в период формирования репродуктивных структур (Малашенко, 1987).
Спецификой роста грибов на нефтепродуктах является их способность распространяться на поверхности, то есть возможность использовать при этом активную воду из воздуха, а также расти в толще нефтепродуктов, то есть ограничивать свои потребности в воде за счет активной воды самих нефтепродуктов (Жданова, Василевская, 1982).
Рост грибов (кладоспориев, пенициллиев, аспергиллов и некоторых других видов и штаммов) в разных нефтепродуктах характеризуется различным типом размещения мицелиальной пленки. Наиболее типичный - на разделе фаз, однако чаще всего наблюдается еще и глубинный рост, при котором развивается не только в толще жидкости - до 20 см. Причем интересно, что рост этих штаммов при определенном соотношении нефтепродуктов и воды мало зависит от высоты слоев смеси, а также воздуха в надсубстратном пространстве. Это свидетельствует о большой возможности мицелиальных грибов выдерживать жесткие условия и приспосабливаться к потреблению необходимых для метаболизма веществ не совсем обычными биохимическими и физиологическими путями.
В настоящее время установлено, что способность окислять углеводороды нефти не является специфической чертой отдельных видов грибов. Это не редкая их особенность, а одна из физиологических функций. Однако, несмотря на большое сходство химических и физических свойств фракций нефтепродуктов, у большинства видов грибов четко проявляется избирательное отношение к их утилизации (Бабьева, 1983).
1.2.9 Разрушение полимерных материалов
Синтез полимеров и создание на их основе материалов, обладающих повышенной стойкостью к факторам окружающей среды и воздействию различных организмов, привел к обострению экологической обстановки из-за накопления больших объемов отходов, содержащих эти соединения в разных отраслях промышленности. В последние десятилетия во многих странах уделяется большое внимание созданию полимерных материалов и их модификаций, утилизация которых возможна под воздействием микробиоты. В качестве добавок к пластификаторам исследователи используют природные компоненты такие, как крахмал, производные целлюлозы, протеин, хитозан и так далее. На основе этих композитных полимеров ряд фирм выпускает пластики для производства изделий разового пользования, упаковки пищевых продуктов, плоских пленок и так далее, которые обладают способностью к биодеградации при компостировании и так далее (Власова, 2001; Фомин, 2001). Состав микроорганизмов, контаминирующих техногенные материалы и способных вызывать их биодеградацию, очень разнообразен как в таксономическом отношении, так и по их физиолого-биохимической активности. Среди них ведущее место занимают представители дейтеромицетов, способные развиваться на обширном сортименте материалов, содержащих соединения как природного происхождения, так и искусственного синтеза (Биоповреждения, 1987; Коваль, 1989).
Было проведено исследование О.В. Сычуговой с соавторами (2003) с целью изучения возможности роста и развития видов микромицетов на композиции пленочного сополимера этилена и винилацетата с термопластичным крахмалом.
В процессе данного исследования оценка возможности потребления разных форм крахмала тест - культурами показала, что они способны утилизировать данный источник углеродного питания. Однако динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, при одной и той же навеске крахмала не одинакова, что особенно четко проявляется на 4-10-е сутки. Выявляется и некоторая разница в темпе роста видов грибов на нативном и растворимом крахмале разного происхождения, а также на средах Чапека и Гетченсона, взятых в качестве контроля (Сычугова, 2003).
Изменения морфологических признаков и образования новых структур у тест - культур на модифицированных средах при замене сахарозы на крахмал и росте на полимере не отмечаются, и они сопоставимы с параметрами, приведенными в определителях (Пидопличко, 1953; Ellis, 1971; Watanabe, 2000). Отличия выявлены у них только в темпах формирования морфологических структур. Хотя в литературе и приведены данные о влиянии субстрата на появление новых морфологических структур у грибов (Богомолова, 2001), однако, вероятнее всего, онтогенез и темпы развития определяются геномом вида, реализация программы которого зависит от влияния различных факторов (Шевцова, 1987; Долгова, 1997).
На поверхности пленки, содержащей термопластичный крахмал фиксируются сформированные пучки конидиеносцев Aspergillus niger, Paecilomyces variotii, Penicillium funiculosum, Chaetomium globosum, Trichoderma viride. Другие виды из взятого набора тест-культур не растут на данном субстрате или формируют слабое спороношение и в более поздние сроки.
Рост мицелия и формирование спороношения на композиции пленочного сополимера дает основание предполагать участие некоторых видов грибов в биодеструкции полимера из сополимеров этилена и винилацетата (СЭВА) с добавлением термопластичного крахмала (ТПК). Это дает возможность при последующих пересевах на смесях СЭВА и ТПК отобрать наиболее активные виды и их штаммы для разработки биотехнологии по его утилизации (Сычугова, 2003).
Таким образом, микроскопические грибы могут использовать в качестве источников углерода разнообразные органические вещества, тем самым являясь важными деструкторами различных природных материалов: целлюлозы, крахмала, лигнина, гемицеллюлозы, жиров, углеводородов, а также синтетических материалов, таких как пластики, пленки, упаковки пищевых продуктов и так далее.
2. Объекты и методы исследований2.1 Объекты исследованийВ качестве объектов исследования были выбраны коллекционные штаммы микромицетов: Aspergillus flavus, A. fumigatus, Alternaria sp., Penicillium sp., Cladosporium sp., Trichoderma sp., Verticillium sp. Культуры были взяты из коллекции культур микроорганизмов кафедры «Прикладная биология и микробиология» АГТУ. Данные виды микромицетов были выделены из основных типов почв Астраханской области и из растительных субстратов: Aspergillus flavus и A. fumigatus из бурой полупустынной почвы Орловского смешанного леса, Alternaria sp. и Cladosporium sp. - из листьев клубники, Cladosporium sp. - из каштановой почвы Дубового леса, Trichoderma sp., Verticillium sp. - из каштановой почвы Ясеневого леса.2.2 Отбор и подготовка почвенного образцаОбразцы почв для микробиологических исследований отбирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые пакеты или стеклянную посуду.При отсутствии возможности анализировать образцы непосредственно после сбора, их в течение нескольких часов высушивают на воздухе, предохраняя от прямых солнечных лучей.При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо провести следующие операции: очистить от камней, трав; разрушить почвенные агрегаты, используя метод растирания почвы в стерильной фарфоровой чашке пестиком (Градова, 2001). 2.3 Методы выделения плесневых грибовПри выявлении и учете микромицетов производят посев из разведения почвенной суспензии на плотные питательные среды. Наиболее часто используют подкисленные молочной кислотой, сусло - агар и синтетические среды с простыми углеводами (например, среда Чапека). Подкисление производят для того, чтобы убить бактерии.При выявлении грибов, которые не развиваются на кислых средах, используют красители: бенгальский розовый, кристаллический фиолетовый, малахитовый зеленый. Применяют также комбинации из красителей и антибиотиков.Грибы, которые не выдерживают конкуренцию за моносахара, выделяют на «голодные среды» - водный агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с разведенным в 8-10 раз суслом. На этих средах микромицеты развиваются значительно медленней и образуют мелкие колонии. При выделении микромицетов, разлагающих целлюлозу, лигнин, гумусовые вещества, источник углерода добавляют к синтетической минеральной среде (Бабьева, 1989).2.4 Методы идентификации плесневых грибовКультуральные признаки грибов описывают на плотных питательных средах в чашках Петри. При описании культуральных признаков грибов отмечают внешний вид колоний, текстуру колоний (бархатистая, шерстистая, шероховатая, войлочная), окраску колоний, диффузию пигмента в агар, складчатость колонии, наличие экссудата.Для характеристики морфологических признаков сначала рассматривают чашки при малом увеличении, а затем готовят микроскопический препарат - раздавленная капля (Бабьева, 1989).Идентификация мицелиальных грибов основана главным образом на сопоставлении макроскопических и микроскопических признаков исследуемой культуры с ранее описанными признаками известных грибов. Для каждой идентифицируемой культуры необходимо определить цвет поверхности (у некоторых организмов и обратной стороны) и фактуру колоний, а также скорость роста по диаметру колоний (макроскопические признаки). Дальнейшая работа по идентификации связана с приготовлением препаратов репродуктивных органов: необходимо отмечать характер септирования гиф, тип конидиогенных клеток и вид их репродуктивных пропагул. Принадлежность грибов устанавливают по наличию разнообразных конидиальных спороношений как открытых, так и внутри специальных вместилищ - пикнид и отсутствии каких-либо половых спороношений. Применяемая на практике идентификация основана в основном на морфологических признаках конидиального спороношения, которые чрезвычайно разнообразны. Принадлежность к классу и роду устанавливают по определителям (Егоров, 1986; Билай, 1987; Саттон, 2001; Еремеева, 2007; Booth, 1971; Pitt, 1991; Klich, 1992).
