2. Цитоскелет
В принципе как трансмембранное, так и латеральное распределение мембранных компонентов может зависеть от их взаимодействия со структурами, находящимися на поверхности мембраны. В ряде случаев такая зависимость была четко выявлена, в частности с этим связан все более возрастающий, интерес к взаимодействию мембраны с цитоскелетом. Цитоскелет -- это сложная сеть волокон разного типа, обнаруженная в эукариотических клетках. У прокариоти-ческих клеток ничего подобного не выявлено. Основная функция этой системы, по-видимому, связана с механикой клетки. Цитоскелет обеспечивает механическую опору для плазматической мембраны и тем самым определяет форму клетки, а также местоположение клеточных органелл и их перемещение при митозе. С подвижностью внутриклеточных мембранных везикул связаны такие процессы, как эндоцитоз, экзоцитоз и фагоцитоз, а также перемещения плазматической мембраны при амебоидном движении клеток. Все эти процессы осуществляются с участием цитоскелета. По сути цитоскелет является динамическим каркасом клетки, который реагирует как на внутренние, так и на внешние стимулы. Часть этой системы тесно связана с плазматической мембраной. В настоящее время лучше всего охарактеризован мембранный скелет эритроцитов млекопитающих. Менее детально изучены биохимические свойства цитоскелета микроворсинок щеточной каемки кишечного эпителия. Обычно ци-тоскелет представляет собой трехмерную сеть волокон, охватывающую всю клетку. В некоторых точках он прикреплен к плазматической мембране, и эти области, как известно, участвуют в межклеточных контактах или в фокальных контактах, с помощью которых клетки прикрепляются к субстрату в клеточных культурах.
Предполагается, что именно благодаря взаимодействиям цитоскелета с мембраной возникает трансмембранное распределение ли-пидов, стабилизируются латериальные белковые домены и обеспечивается направленное перемещение белков в мембране.
Цитоскелетную сеть образуют три типа волокон: 1) микрофила-менты, состоящие из актина и связанных с ним белков; 2) промежуточные филаменты, состоящие из кератинов и родственных им белков; 3) микротрубочки, состоящие из тубулина. В биохимическом отношении лучше всего изучено связывание с мембраной актиновых мик-рофиламентов. Особого рассмотрения здесь заслуживает актин-спектриновая сеть эритроцитов. Эти белки способствуют объединению актиновых волокон в пучки, прикрепляют филаменты к мембране, образуют сшивки в актине, регулируют длину филаментов, влияют на их сократительную способность и обеспечивают отклик на Са2 +. В ряде случаев актин участвует в сократительной активности. Микрофиламенты разрушаются цитоха-лазинами.
Микрофиламенты могут располагаться параллельно цитоплазматической мембране, как в сократимом кольце в делящейся клетке, или могут быть связаны с плазматической мембраной одним своим коццом, как в местах адгезии в области контакта клетка--клетка или клетка--субстрат. Полагают, что связывание актина с мембранами обеспечивается несколькими мембранными белками. Из данных о физической близости микро-филаментов к мембране, о биохимических взаимосвязях микрофила-ментов и разрушающем воздействии цитохалазина следует, что микрофиламенты участвуют во многих мембранных процессах, в частности в опосредуемом рецепторами эндоцитозе, пэтчинге и кэппинге, клеточной подвижности и цитокинезе. С биохимической точки зрения лучше всего охарактеризованы взаимодействия актина с мембраной у эритроцитов.
ПРОМЕЖУТОЧНЫЕ ФИЛАМЕНТЫ
Это полимеры, состоящие из одного или двух фибриллярных полипептидов, которые различаются в клетках разного типа и кодируются семейством мультигенов. Примером являются кератины из эпителиальных клеток и виментин из клеток мезенхимы.
Функции промежуточных филаментов неизвестны. Мало что можно сказать и о биохимической основе их взаимодействия с мембранами.
МИКРОТРУБОЧКИ
Они состоят из тубулина, который хорошо охарактеризован и представляет собой а/?-гетеродимерный белок. Микротрубочки образуют цитоплазматическую сеть, которая, как полагают, связывает плазматическую мембрану с органеллами, например с митохондриями. Вдоль микротрубочек, по-видимому, происходит перемещение эндосом и лизосом. Есть доказательства, что тубулин прикрепляется к мембранам в особых точках. Выделен мембранный белок синапсин I, который, по-видимому, взаимодействует с тубулином. В ходе митоза цитоплазматическая сеть микротрубочек распадается и перестраивается в митотическое веретено. Микротрубочки разрушаются под действием колхицина.
МЕМБРАНА И ЦИТОСКЕЛЕТ ЭРИТРОЦИТОВ
Наиболее детально изучены мембрана и цитоскелет эритроцитов млекопитающих. В табл. 4.2 перечислены основные белки, которые были разделены с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза. Цифровые обозначения полипептидов связаны с их относительной электрофоретической подвижностью в геле. При промывании мембраны растворами с низкой ионной силой удаляются периферические мембранные белки, к которым прежде всего относятся компоненты цитоскелета. Основными интегральными белками цитоскелета являются белок полосы 3 и гликофорины А, В и С. Белок полосы 3 представляет собой анионный переносчик, а функции гли-кофоринов, относящихся к классу гликопротеинов, неизвестны. В электронном микроскопе цитоскелет выглядит как упорядоченная сеть на внутренней стороне мембраны. Как видно из табл. 4.2, белки цитоскелета являются основными мембранными компонентами, и это облегчает их биохимическую характеристику. По сути белковый каркас состоит из спектрин-актинового комплекса, который связан с плазматической мембраной благодаря взаимодействиям как с белком полосы 3, так и с гликофорином; эти взаимодействия осуществляются с помощью специальных белков -- ан-
Таблица 2. Свойства, степень ассоциации и функции эритроцитарных мембранных белков
кирина и белка полосы 4.1. Основные компоненты были очищены до гомогенного состояния и изучены in vitro. Комплексы между основными белками, такими, как белок полосы 3 и анкирин или анкирин и спектрин, характеризуются константами диссоциации порядка Ю-7 М, которые могут меняться в физиологических условиях. Фосфорилирование анкирина влияет на его аффинность по отношению к спектрину, а взаимодействие между белком полосы 4.1 и гликофорином, по-видимому, модулируется фосфатидилинози-толами.
Интересно, что белки, близкородственные компонентам цитоскелета эритроцитов, обнаружены в ряде неэритроидных клеток. Большой интерес к цитоскелету эритроцитов, по всей вероятности, обусловлен тем, что данная система не является уникальной лишь для этих клеток, а представлена в виде кортикального цитоскелета и в клетках другого типа. Рассмотрим свойства некоторых цитоскелет-иых белков.
1. Спектрин. Это тетрамер типа г, в котором два гетероди-мера a/J объединены по схеме «конец-к-концу». Молекула может достигать в длину 2000 А. Спектрин связан с анкирииом и белком полосы 3 по сайтам, расположенным на противоположных концах молекулы. Кроме того, спектрин связан с актином, возможно, в комплексе с белком полосы 4.1. Спектринопо-
добные молекулы, например фодрин, обнаружены в клетках разного типа.
Актин. Это глобулярный белок, который существует в виде линейных олигомеров, содержащих по 12--18 молекул. Они выглядят на электронных микрофотографиях как короткие стержни, к которым может быть прикреплено до шести спектриновых тетрамеров.
Анкирин. Это наиболее охарактеризованный растворимый белок, обеспечивающий взаимодействия между интегральными мембранными белками и цитоскелетом. Он имеет отдельные домены, ответственные за независимое связывание со спектрином и с цитоп-лазматическим доменом белка полосы 3. Анкирин был обнаружен и в неэритроидных клетках.
Белок полосы 4.1. Он также относится к классу белков, обеспечивающих связь цитоскелета с мембраной. Белок полосы 4.1 связывается со спектрином и актином, а также с гликофорином. Кроме того, при определенных условиях он может связываться и с белком полосы 3. Белку полосы 4.1, по-видимому, родствен синапсин I, обнаруженный в мембране синаптических везикул.
5. Белок полосы 3. Это основной анионный переносчик в эритроцитах. Цитоплазматический домен содержит на N-конце кислый участок, который связывается с некоторыми гликоли-тическими ферментами, а также с гемоглобином. Цитоплазматический домен не участвует в транспорте анионов. Его сегмент, расположенный вблизи мембраны, связывается с анкири-ном и с белком полосы 4.2. На основании анализа аминокислотной последовательности было высказано предположение, что белок полосы 3 имеет 12 трансмембранных сегментов, но полученные к настоящему времени экспериментальные данные не позволяют ни подтвердить, ни опровергнуть это положение.
6. Гликофорин А. Это основной сиалосодержащий гликопротеин; В отличие от белка полосы 3 он имеет относительно небольшой цитоплазматический домен и один трансмембранный сегмент. Полагают, что этот белок связывается с белком полосы 4.1. Другие его функции неизвестны.
Трансмембранная асимметрия липидов
Мембранные белки, находясь в плоскости бислоя, не меняют Свою топологическую ориентацию. Они встраиваются в мембрану в jCTporo определенной ориентации и остаются в таком положении в течение всего времени их жизни. Липиды ш ряде биологических мембран, напротив, с довольно большой частотой мигрируют с одной стороны мембраны на другую. Определить скорость трансмембранной миграции липидов очень важно по двум причинам: это помогает понять Природу липидной асимметрии и позволяет критически оценить пригодность методов, используемых для нахождения распределения липидов между двумя сторонами бислоя. Чтобы измерения содержа-1кия, например, фосфатидилсерина на наружной стороне мембранных везикул были достоверными, они должны быть завершены до того, как фосфатидилсерин из внутреннего монослоя переместится в наружный. Некоторые методы установления липидной асимметрии модифицируют саму изучаемую систему и индуцируют трансмембранную миграцию липидных молекул, поэтому полученные результаты бывает трудно интерпретировать. Детальная оценка достоинств и недостатков методов изучения липидной асимметрии в мембранах дается, например, в обзорах.
МЕТОДЫ УСТАНОВЛЕНИЯ ТРАНСМЕМБРАННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ
Химическая модификация фосфолипидов
Относительно легко подвергаются химической модификации только аминофосфолипиды, например фосфатидилсерин и фосфати-дилэтаноламин. При этом мембранный препарат с известной топологической ориентацией обрабатывают реагентом, который не проникает через бислой и ковалентно связывается со свободными аминогруппами тех аминофосфолипидов, которые находятся только на наружной поверхности мембраны. Чаще всего с этой целью используют ТНБС. Доля фосфатидилэтаноламина, вступившего в реакцию, должна служить мерой его содержания на наружной стороне мембраны. Очевидно, однако, что такой вывод неправомочен, если реакция не доходит до конца или если в ходе реакции значительное количество фосфатидилэтаноламина перемещается с внутренней стороны мембраны на наружную и становится доступным для реагента. Как правило, в реальной ситуации имеют место оба обстоятельства, что значительно осложняет интерпретацию результатов.
Предложен вариант этого подхода, предусматривающий синтез аналогов фосфолипидов с реакционноспособными сульфгидрильны-ми группами с последующим использованием непроникающих реагентов, избирательно реагирующих по SH-группам. Естественно, что эти липидные аналоги следует включать в изучаемые мембраны перед обработкой реагентами, и желательно предварительно исследовать их поведение в модельных системах.
Фосфолипидный обмен
Спонтанный обмен фосфолипидами между мембранами, как правило, протекает с пренебрежимо малой скоростью. Однако были выделены белки, называемые липидпереносящими белками, которые катализируют обмен. Эти белки чаще всего выделяют из тканей млекопитающих. Наиболее изучен белок из печени крысы, который обладает абсолютной специфичностью по отношению к фосфатидилхолину и катализирует его обмен между мембранами. Большинство других липидперенося-щих белков менее специфичны к полярным головкам липидных молекул. Это растворимые белки, которые имеют высокоаффинные места связывания фосфолипидных молекул. Механизм обмена неизвестен, однако ЛПБ можно использовать для изучения липидной асимметрии, поскольку они связывают липиды только наружной поверхности бислоя, с которыми они контактируют. Обычно мембранные везикулы инкубируют с избытком липосом, содержащих радиоактивно меченный фосфолипид, в присутствии липидперенося-щего белка. Фосфолипидный обмен со стехиометрией 1:1, который катализируется указанными белками, не приводит к изменению состава мембран, при этом степень обмениваемости фосфолипидов можно определить, измерив удельную радиоактивность мембраны. Если фосфолипид в мембране полностью доступен для обмена, то его удельная радиоактивность в липосомах и мембранах в конце эксперимента будет одинаковой. Если же изучаемый липид на внутренней стороне мембраны недоступен для обмена, то его удельная радиоактивность в мембране будет ниже, чем в липосомах. Если трансмембранная миграция протекает медленнее, чем устанавливается равновесие при обмене, то удельная радиоактивность будет возрастать во времени, и это возрастание будет отражать скорость флип-флопа. При проведении этих экспериментов необходимо отделять липосомы от изучаемых мембран; для этого обычно используют центрифугирование.
Достоинство этой методики состоит в том, что ЛПБ не проникают через мембрану, недостаток же связан с тем, что равновесие устанавливается медленно, за несколько часов или даже больше. Поэтому данная методика неприменима, когда происходит быстрая трансмембранная миграция, но ее можно использовать в сочетании с другими методами. Например, можно провести обмен радиоактивных липидов, находящихся на наружной поверхности бислоя, а затем использовать фосфолипазы для оценки скорости, с которой эти липи-ды мигрируют с наружной стороны мембраны на внутреннюю.
Фосфолипазы
Фосфолипазы -- это ферменты, гидролизующие фосфолипиды по связям, указанным на рис. 4.3. Фосфолипазы представляют собой
растворимые белки, которые взаимодействуют только с наружной поверхностью бислоя и поэтому являются ценным инструментом для изучения асимметрии фосфолипидов и скорости их трансмембранной миграции. При работе с фосфолипазами следует иметь в виду два момента: 1) не все фосфолипиды на наружной стороне мембраны легко вступают в реакцию; 2) продукты реакции обычно дестабилизируют бислой. Даже если при действии фосфолипаз целостность бислоя не нарушается, скорость трансмембранной миграции фосфолипидов может существенно возрасти. Поэтому ход реакции необходимо тщательно контролировать, а выводы, сделанные на основании полученных результатов, -- критически анализировать.
Другие методы
Для установления трансмембранного распределения липидов были предложены и другие специальные методы. Рассмотрим некоторые из них.
Распределение кардиолипина можно определить по специфичному связыванию с ним адриамицина.
Распределение гликолипидов можно определить, окисляя их либо галактозооксидазой, либо периодатом натрия с последующим восстановлением 3Н-боргидридом натрия.
Распределение стеролов можно определить несколькими методами. Стеролы могут самопроизвольно обмениваться между мембранами даже без участия особых белков. Поэтому их присутствие в наружном монослое мембраны можно определить по переносу в липосомы или из липосом. Распределение холестерола между двумя сторонами мембраны устанавливали, изучая кинетику образования комплекса между ним и филипином. Наконец, для определения содержания холестерола в наружном монослое мембраны использовали холестеролоксидазу, однако возникающие при этом артефакты ставят возможность применения этого фермента под сомнение.
ПРИМЕРЫ ЛИПИДНОЙ АСИММЕТРИИ
Из-за экспериментальных трудностей, связанных с определением липидной асимметрии, можно привести лишь несколько примеров, в которых асимметрия несомненно доказана. Прежде всего следует упомянуть эритроциты человека, которые в этом отношении были, детально изучены, причем все использованные методы дали хорошо согласующиеся между собой результаты. Другой пример такого рода -- это высокая степень асимметрии наружной мембраны грамот-рицательных бактерий; впрочем, эта мембрана необычна в том отношении, что ее основным компонентом является уникальный липо-полисахарид. Нет никаких сомнений, что асимметричное распределение липидов свойственно и другим биологическим мембранам, однако убедительные данные получены лишь в немногих случаях.
Липидная асимметрия в фосфолипидиых везикулах
Для малых моноламеллярных везикул, состоящих из двух разных липидов, характерно асимметричное распределение липидов. Например, в везикулах, состоящих из смеси фосфатидилхолина с другими липидами, наружный монослой обогащен сфингомиелином или фосфатидилглицеролом, а фосфати-дилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол и фосфа-тидная кислота предпочитают находиться на внутренней поверхности. Общепризнано, что в этих случаях липидная асимметрия возникает прежде всего из-за различий в упаковке молекул на двух сторонах бислоя ММВ. Липиды с более объемными полярными головками стремятся находиться в наружном монослое, потому что там больше площадь поверхности, приходящейся на молекулу. Однако биологические мембраны, за отдельными исключениями, не имеют участков со столь большой кривизной, так что эти выводы нельзя безоговорочно распространить на любые биологические мембраны. С помощью трансмембранного градиента рН липидную асимметрию можно индуцировать и в больших моноламеллярных везикулах.
Липидная асимметрия в эритроцитах человека
Четко показано, что распределение липидов в мембране эритроцитов в высшей степени асимметрично. Как видно из рис. 4.4, фосфа-тидилхолин и сфингомиелин находятся преимущественно в наружном монослое, тогда как фосфатидилэтаноламин и фосфатидилсе-рин -- в основном во внутреннем.
Имеются убедительные данные о том, что для сохранения липидной асимметрии необходима целостность цитоскелета. Она нарушена в клетках, дефицитных по спектрину или белку полосы 4.1. Воздействия, нарушающие цитоскелет, изменяют и липидную асимметрию, хотя неясно, являются ли эти эффекты прямым следствием повреждения цитоскелета. Кроме того, в малых везикулах, полученных из мембраны эритроцитов, распределение липидов менее асимметрично. Эти данные показывают, что цитоскелет играет определенную роль в поддержании липидной асимметрии. Механизм такого влияния неясен, однако можно предположить, что имеет место прямое связывание цитоске-летных белков с аминофосфолипидами.
Прямая стабилизация асимметрии, если она существует, -- это только одна сторона вопроса. Так, экзогенные фосфолипиды, включенные в мембрану эритроцитов с помощью обменивающих белков, примерно через сутки перераспределяются, и их асимметрия принимает такой же характер, как и у эндогенных липидов. На рис. 4.5 приведена схема этих экспериментов. Измеряя кинетику гидролиза под действием фосфолипаз, можно определить скорость флип-флопа липидных молекул. Эта скорость возрастает в ряду фосфатидилсерин > фосфатидилэтаноламин > фосфатидил-холин > сфиигомиелии. Подобные результаты были получены с помощью спин-мечеиных липидов и лизофосфолипидов. Таким образом, те липиды, которые локализуются на внутренней стороне мембраны, имеют и относительно большую скорость транс-мембраииой миграции. Те же липиды, которые находятся на наружной стороне, мигрируют значительно медленнее либо вообще не совершают флип-флоп-перескоков.
