2) выделение неочищенного продукта (80% чистоты), который можно использовать в животноводстве;
3) дальнейшую очистку до уровня 91-98% (для медицинских целей).
Для экстракции витамина из клеток последние нагревают при 80о-120оС в течение 10-30 мин при рН 6,1-8,5. Превращение в CN-кобаламин достигают, обрабатывая горячий раствор или клеточную суспензию цианидом или тиоционатом, часто в присутствии NaNO2 или хлорамина В. Корриноиды сорбируют на различных носителях: амберлите IRC-50, А12О3, активированном угле и элюируют водными спиртами или водно-фенольными смесями. Из водных растворов корриноиды экстрагируют фенолом или крезолом или смесью этих спиртов с бензином, бутанолом, углеродистым тетрахлоридом или хлороформом.
При упаривании различных растворителей получают осадок или кристаллы витамина, которые растворяют в соответствующем растворителе до нужной концентрации. Выход витамина B12 при использовании пропионовокислых бактерий - 25-40 мг/л. Но есть патентное сообщение (Франция) о достижении невероятно высокого выхода - 216 (Емцев, Мишустин, 2006).
Глава 2
2.1 Объекты и методы исследований
Объектом настоящего исследования является почва, отобранная в парковой зоне в районе АГТУ. Почва рассыпчатая, коричневого цвета, сильно гумусированная, не подвергающаяся антропогенному воздействию.
Для взятия проб почвы использовали стерильную посуду и лопату. Почву отбирали с поверхностного слоя, глубиной не более 2 см. и помещали в полиэтиленовые пакеты. Отбор проб производился в марте 2007 г.
Методы стерилизации. При любой микробиологической работе: при посевах, выделении, пересевах, сохранении чистых культур - используются стерильные среды, стерильная посуда, стерильные инструменты, чтобы предотвратить возможность попадания посторонней микрофлоры.
Стерилизация - один из важных и необходимых приемов в микробиологической технике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского (sterilis) означает обеспложивание. В микробиологии под стерилизацией понимают гибель всех живых микроорганизмов. В микробиологической практике стерилизуют питательные среды, посуду, инструменты и другие необходимые материалы, чтобы не допустить развития посторонней микрофлоры.
Посуду перед стерилизацией тщательно моют, сушат и завертывают в бумагу для сохранения стерильности после прогревания.
Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги, шириной 4-5 см. В концы пипеток, которые предварительно вставляют ватные тампоны. Обмотку начинают с противоположного конца постепенным движением бумаги по спирали и оканчивают у конца с тампоном. Завернутые пипетки для предохранения бумаги от загрязнения и разрывов заворачивают по несколько штук вместе или помещают в специальные металлические или картонные пеналы. Шпатели обертывают по отдельности аналогично пипеткам, используя для обмотки полоски бумаги большей ширины. Чашки Петри заворачивают вместе по 2-4 штуки. Колбы, пробирки и другие сосуды закрывают ватными пробками, а сверху бумажными салфетками.
Стерилизация посуды. Для получения стерильной посуды используется стерилизация сухим жаром. Она производится нагреванием в течение 2 часов при температуре 170оС в печи Пастера или в электросушильных шкафах (с нагревом до 200о С).
При отсутствии сушильных шкафов, стерилизация посуды может быть произведена на автоклаве или в духовом шкафу плиты (побурение бумаги показывает достаточность нагрева).
Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта, высушена и завернута в бумагу. Баллоны, склянки, трубки, пипетки заворачивают в бумагу поодиночке, и в этой бумаге они сохраняются до момента использования. Чашки Петри могут быть завернуты по 2--3 вместе. Пипетки перед стерилизацией затыкают с широкого конца ватой и заворачивают (закатывают) в узкие, длинные ленты бумаги, начиная с оттянутого кончика.
Пробирки должны быть закрыты ватными пробками. Для заворачивания посуды при стерилизации и сушильном шкафу лучше пользоваться тонкой бумагой (лимонной или папиросной), при стерилизации в автоклаве -- газетной (которая не размокает). Нельзя стерилизовать посуду, закрытую притертыми пробками.
Для получения стерильных игл, петель при производстве посевов, взятии материала из культур для приготовления мазков пользуются стерилизацией прокаливанием на пламени. При этом па пламени (спиртовки, газовой горелки) подвергают кратковременному обжиганию горлышки пробирок, колб, пробки и т. д.
Стерилизация автоклавированием применяется, главным образом, для стерилизации питательных сред. Этот способ основан на прогревании насыщенным паром при давлении выше атмосферного, т. е., при температуре выше 100оС и осуществляется в специальных аппаратах- автоклавах.
Совместное действие высоких температур и пара обеспечивает надежность стерилизации - гибель вегетативных клеток и спор микроорганизмов. Автоклавирование проводят при различных режимах, при дополнительном давлении 50,100,200 кПа (Градова и др., 2001).
Приготовление питательных сред. При составлении питательных сред необходимо учитывать потребность микроорганизмов в элементах питания. По составу среды подразделяют на две группы: естественные и синтетические.
С.Н. Виноградским в практику микробиологии введены элективные (избирательные среды для определенных групп микроорганизмов, обеспечивающие преимущественное развитие одного вида или группы родственных микроорганизмов и менее пригодные или совсем не пригодные для развития других.
Зная физиологические особенности соответствующей группы микробов, можно подобрать такие условия культивирования, при которых будут развиваться лишь представители этой группы. Применяют питательные среды различной консистенции: плотные, жидкие, полужидкие (Теппер и др., 1987).
Для выделения маслянокислых бактерий используется среда Виноградского (г/л):KH2PO4- 1,0 г.; MgSO4 * 7H2O -0,5 г.; NaCl - 0,5 г.; MnSO4- 0,01 г.; Fe2 (SO4)3*9H2O- 0,01 г.; CaCO3- 20г.; KNO3- 4г.; дистиллированная вода - 1л.
При посеве исследуемой почвы 1 г. растертой стерильным пестиком в ступке почву помещали в пробирку с 10 г. стерильной воды. Затем производили ряд последовательных разведений; 10-1 - 10-7 разведения разливали по 1 мл в большие стерильные пробирки методом глубинного посева. В полученную культуральную жидкость заливали жидкую среду Виноградского до ? объема. Пробирки со средами помещают в водяную баню при 80оС на 10-15 мин., так как при кипячении в культуральной жидкости создаются анаэробные условия. Посевы помещают в термостат при температуре 30-35 ос. Инкубация производится в течение 2-3 дней.
При исследовании культуральных признаков обращают внимание на следующие признаки:
1. Изменение цвета среды (изначально среда прозрачная). Цвет меняется от желтого до коричневого.
2. Образование осадка
3. Появление мути.
4. Образование пленки.
Культуру отбирают из середины столбика жидкости и эту каплю помещают на середину предметного стекла, накрывают покровным стеклом и к краю предметного стекла подносят пипетку с раствором Люголя. К другому краю - фильтровальную бумагу, которая засасывает раствор под покровное стекло.
При микроскопировании препарата хорошо видны клетки клостридий с потемневшим содержанием, так как перед спорообразованием в клетках накапливается много гранулезы, которая при взаимодействии с Люголем дает темное окрашивание (Теппер и др., 1987).
Микроскопирование маслянокислых бактерий. Питательную среду из колбы Вюрца или пробирки берут пипеткой, закрыв указательным пальцем верхний конец и погрузив ее в средний слой сброженной жидкости. Слегка приподняв палец, набирают в пипетку жидкость, снова зажимают пальцем верхний конец пипетки и, вынув ее из колбы, наносят каплю на предметное стекло. К накопительной культуре добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом, на которое помещают каплю кедрового масла. При микроскопировании препарата обнаруживаются клетки, в которых можно заметить овальные тельца, сильнопреломляющие свет (споры). В тех местах клетки, где содержится гранулеза, возникает сине- фиолетовое окрашивание. Зарисовывают только окрашенные клетки, явно относящиеся к группе маслянокислых бактерий.
При постановке накопительной культуры целлюлозоразлагающих аэробных бактерий используют среду Гетченсона. Слой среды Гетченсона-1 см. Вносят 0,5 -1 г. почвы и на кончике шпателя - мел. Колбу закрывают ватной пробкой, помещают в термостат на 10-14 суток. Бумага становится ослизненной и распадается, конус оседает на дно.
Для получения целлюлозоразрушающих аэробных бактерий используют среду (г/л): КН2РО4-0,1; NaCl -0,1; CaCl2-0,1; TeCL3-0,1; MgSO4 *7Н2О- 0,3; NaNO3-2,5; агар-агар -2%.
Среду разливают в чашки Петри и на поверхность накладывают фильтровальную бумагу, нарезанную по размеру чашки Петри и предварительно тоже простерилизованную.
Стеклянной палочкой с оттянутым концом на поверхность фильтра раскладывают параллельными рядами комочки почвы на расстоянии 1см. (по трафарету). Засеяны чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят в термостат при 25-30оС.
Через 10-14 суток вокруг комочков почвы развиваются комочки целлюлозоразлагающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В местах образования колоний фильтровальная бумага разлагается, ослизняется, становится прозрачной. По морфологии можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Принимая общее число высеянных комочков почвы за 100%, можно подсчитать в процентах число комочков почвы, давших колонии целлюлозоразлагающих микроорганизмов. Из зон разрушения клетчатки готовят препарат « раздавленная капля» и описывают выделенные различные целлюлозоразрушающие микроорганизмы.
Микроскопирование целлюлозоразлагающих бактерий. Извлекают пинцетом со дна колбы кусочек разлагающейся бумаги и размазывают на предметном стекле без добавления воды. Мазок сушат обычным способом, фиксируют на пламени горелки и окрашивают фуксином.
Для накопительной культуры анаэробных целлюлозоразрушающих бактерий используют среду, предложенную Имшенецким: мясопептонный бульон - 500 мл, СаСО3 - 2 г, фильтровальная бумага-15 г, водопроводная вода- 0,5 л.
Среду разливают высоким слоем в высокую пробирку. На дно опускают нарезанную полосками фильтровальную бумагу. Пробирки закрывают ватными пробками, затем пробирки стерилизуют и засевают комочком почвы или навоза. Инкубируют в течение суток в термостате при 30-35оС для обнаружения мезофильных бактерий и при 60оС - для поиска термофильных бактерий.
Через 3-4 суток при 60оС в пробирках начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяется газ. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу и оседают на дно. При 30-35оС разрушение клетчатки происходит медленнее. Разрушенные массы клетчатки подвергаются микроскопическому анализу. Готовят фиксированный препарат - окрашивание фуксином (Родина, 1968).
Маслянокислое брожение крахмала исследуют на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими 1/3 высокой пробирки, добавляют немного мела, заливают водопроводной водой на 2/3 и помещают в водяную баню при 80о на 19 мин для пастеризации. В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бактерий, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры. Элективные условия создают: крахмалом- источником углерода, используемым только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу; пастеризацией; анаэробиозом (высокий столбик жидкости в пробирке и выделение в процессе брожения СО2 и Н2, вытесняющих воздух). Через 2-3 дня картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. По окончании брожения культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых бактерий и качественного определения продуктов брожения.
Качественная реакция на масляную кислоту. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl3). Нейтральные растворы маслянокислых солей при нагревании с FeCl3 приобретают коричневое окрашивание вследствие образования маслянокислого железа. В пробирку наливают 3-5 мл сброженной жидкости, добавляют 1-2 мл 5%- ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению:
3Ca (CH3CH2CH2COO) 2 + 2Fe2Cl3 > 2Fe (CH3CH2CH2COO) 3 + 3CaCl2
Раствор маслянокислого железа в отраженном свете приобретает буровато-коричневое окрашивание, а в проходящем свете - кроваво-красное.
Техника посева культур микроорганизмов. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на твердых и жидких средах в пробирках, колбах или в чашках Петри.
Посевом в микробиологии называется внесение клеток микроорганизмов (посевного материала - инокулята) в стерильные среды.
Пересев- это перенос выращенной культуры микроорганизмов на питательной среде на другую свежую питательную среду.
Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.
Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. Пробирки при взятии мазка необходимо удерживать в наклонном положении, чтобы гарантировать стерильность культуры. Если их держать вертикально, то возможно попадание посторонних клеток микроорганизмов.
В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую петлю, держа ее в правой руке в отвесном положении. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью, пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и переносят во вторую пробирку.
Окраска клеток микроорганизмов по Граму. Метод дифференциации микробных клеток, основанный на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у других видов это соединение временно появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микробы первой группы называются грамположительными, второй - грамотрицательными.
Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них- контрольные с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклоненном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая ,96% -ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат окажется перекрашенным.
Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно - фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски (фуксина) (Теппер и др., 1987).
2.2 Модельные микроэкосистемы
Небольшие автономные «миры» или микрокосмы, в бутылях или других сосудах могут имитировать в миниатюре природу различных экосистем. Эти небольшие «миры» можно рассматривать как Микроэкосистемы. Создание небольших, полностью закрытых систем, нуждающихся в лишь одной световой энергии (своеобразные миниатюрные биосферы), - очень сложная задача. Экспериментальные микрокосмы обычно варьируют от частично закрытых систем, в которых происходит газообмен с атмосферой, но не происходит обмена биогенными элементами и организмами, до полностью закрытых систем, включающих сообщества организмов, содержащихся в различных хемостатах и турбидостатах с регулируемым притоком и оттоком биогенных элементов и организмов. В хорошо смоделированных микрокосмах можно наблюдать многие или даже почти все основные функции и трофические структуры природной экосистемы, однако в силу необходимости разнообразие и размеры компонентов таких микрокосмов крайне невелики. Преимущества микроэкосистем для исследователя заключаются в том, что они имеют четкие границы, легко воспроизводимы и удобны для экспериментов. Не следует, однако, думать, что микрокосмы представляют собой копии той или иной конкурентной экосистемы, это всего лишь живые работающие модели (упрощения) природы.
Можно выделить два типа биологических микрокосмов:1) микроэкосистемы, взятые непосредственно из природы путем множественного засева культуральной среды пробами из различных природных местообитаний, и 2) системы, созданные путем сочетания видов, выращенных в «чистых» или аксенических, культурах (свободных от других организмов), пока не получится желаемая комбинация. Системы первого типа - это, в сущности, «демонтированная» или «упрощенная» природа, сведенная к тем микроорганизмам, которые могут длительное время поддерживаться и функционировать в условиях выбранного экспериментатором сосуда, культуральной среды, освещенности и температуры. Такие системы, следовательно, обычно имитируют какие - то определенные природные ситуации. Одна из проблем, возникающая при работе с такими производными экосистемами, состоит в том, что трудно определить их точный видовой состав, особенно состав бактерий (den et al, 1969). Начало использованию в экологии производных или «множественных» систем положили работы Г. Одума и его учеников (H. Odum, Hoskins, 1957; Beyers, 1963).
При втором подходе путем подбора первоначально изолированных и тщательно изученных компонентов создается система с известным составом. Получаемые при этом культуры часто называют гнотобиотическими (этот термин обсуждается в работе Догерти (Dougherty, 1959)), поскольку здесь точно известен состав и даже то, присутствуют или отсутствуют бактерии. Гнотобиотические культуры прежде использовали главным образом для изучения питания, биохимии и других аспектов жизни отдельных видов и штаммов или для изучения взаимодействия двух видов. Однако в последнее время экологи начали экспериментировать с более сложными полиаксеническими культурами в поисках путей построения автономных экосистем (Nixon, 1969; Taub, 1969, 1974).
Эти два противоположных подхода к созданию лабораторных микроэкосистем параллельны двум давно существующим подходам (холистическому и мерологическому) экологов к изучению озер и других больших систем, существующих в природе.
Существует широко распространенное заблуждение относительно «равновесия» в аквариуме с рыбами. Вполне возможно достигнуть некоторого приблизительного равновесия газового и пищевого режима при условии, что в нем мало рыб, а воды и растений много. Еще в 1851 г. Дж. Уорингтон «установил это удивительное и восхитительное равновесие между животным и растительным царствами» в аквариуме объемом 12 галлонов (54,6 л), поселив в нем несколько золотых рыбок, улиток и большое количество валлиснерии (водное растение), а с ними и множество разнообразных микроорганизмов. Уорингтон правильно оценил не только взаимодействие рыб и растений, но и отметил значение детритоядных улиток «в разложении остатков растений и водорослевой слизи», в результате чего «то, что иначе могло бы действовать как ядовитое начало, превращается в плодородную среду для роста растений». Большинство попыток любителей добиваться равновесия в аквариуме терпит неудачу из-за того, что для наличного количества ресурсов в аквариум помещают слишком много рыб (диагноз: элементарный случай перенаселения). Для полного самообеспечения одной рыбе среднего размера требуется много кубических метров воды и организмов, служащих пищей. Поскольку аквариум обычно держат дома, на работе или в школе ради «наблюдения за рыбами», помещая большое число рыб в малом пространстве, необходимо дополнительное питание, аэрация и периодическая очистка аквариума (Одум, 1986).
