. Реконструкция без избытка детергента

Условия включения мембранных белков в предварительно сформированные фосфолипидные везикулы часто совпадают с условиями, способствующими слиянию фосфолипидных везикул. В основе обоих процессов лежат определенные нарушения бислойной структуры, или образование "дефектов", которые могли бы облегчить как встраивание белка, так и слияние везикул. Механизмы этих процессов изучены мало. Возможной трудностью в применении этих методов является агрегация белка.

1. Инкубация белка с заранее полученными везикулами. Этот способ применим далеко не всегда и используется для реконструкции не пронизывающих бислой белков с ограниченной гидрофобной поверхностью, например цитохрома bs и /З-гидроксибутиратдегидрогеназы. Конформация встроенного таким образом белка, однако, отличается от нативной.

Реконструкция с участием амфифильных катализаторов. В ряде работ было показано, что добавление в белково-фосфолипидную смесь амфифильных веществ в низких концентрациях облегчает встраивание в везикулы таких мембранных ферментов, как бактериородопсин или цитохром с-оксидаза. В качестве амфифильных веществ использовали холестерол, короткоцепочечные фосфатидилхолины и жирные кислоты. Данный способ хорош тем, что в нем не используются какие-либо грубые процедуры, в том числе обработка избытком детергентов, однако пока он мало распространен.

Замораживание-оттаивание/обработка ультразвуком. В некоторых случаях с успехом используется метод замораживания-оттаивания смеси с последующей обработкой ультразвуком. Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание-оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более крупные и более однородные по размерам.

2. Реконструкция с использованием детергентов

В настоящее время для реконструкции гораздо чаще используют методики, состоящие в солюбилизации смеси белка и фосфолипида детергентом и последующем удалении детергента. После его удаления белок и фосфолипид спонтанно формируют однослойные везикулы, вполне пригодные для энзимологических исследований. Обычно выбирают детергенты с высокой критической концентрацией мицеллообразования и малыми размерами мицелл, с тем чтобы их можно было легко удалить диализом или гельфильтрацией. Чаще всего используют холат натрия и октилглюкозид. Распределение полученных везикул по размерам определяется соотношением детергент: фосфолипид, а также способом и скоростью удаления детергента. Обычно используют диализ как более медленный способ. В качестве примеров можно привести встраивание цитохром с-оксидазы и Na + /K+-ATPa3bi.

С помощью такой методики можно ввести в везикулы отличные от фосфолипидов вещества, например холестерол или убихинон. В ряде случаев возникает необходимость в достаточно быстром удалении детергента, особенно если белок нестабилен при его избытке. Тогда применяют гельфильтрационную хроматографию, тоже позволяющую эффективно отделить белково-липидные везикулы от детергента. На рис.1 показан профиль элюции с такой колонки.

Еще более быстрым является метод разведения, когда белково-липидно-детергентную смесь разводят до концентрации детергента много меньшей, чем критическая концентрация мицеллообразования. При этом спонтанно образуются белково-фосфолипидные везикулы, которые можно отделить от детергента центрифугированием.

Обычно используемый для очистки мембранных ферментов тритон Х-100 весьма неудобен при реконструкции, поскольку его трудно Удалить из системы. Для удаления тритона применяют шарики из полистирола, и одна из проблем - потеря белка из-за его сорбции на поверхности шариков. В качестве примера белка, реконструируемого этим методом, можно привести натриевый канал.

И наконец, для реконструкции применяли метод, основанный на диспергировании смеси холестерол-фосфолипид-белок в диэтиловом эфире и последующем испарении обращенной фазы.

Однако маловероятно, что многие белки выдержат такую процедуру.

3. Некоторые характеристики реконструированных белково-фосфолипидных везикул

В результате применения всех методов, разработанных для реконструкции мембранных белков, образуются однослойные везикулы. Характеристики некоторых из них детально изучены. Это, в частности, протеолипосомы, содержащие цитохром с-оксидазу, Ыа + /К+-АТРазу, цитохром Ь5 и гликофорин. Особый интерес представляют:

1) средний размер везикул и распределение их по размерам;

2) распределение белка в популяции везикул;

3) ориентация белка по отношению к плоскости бислоя;

4) проницаемость везикул. Эти характеристики особенно важны, если фермент катализирует трансмембранный перенос веществ или ионов. Для количественного анализа кинетики таких ферментов необходимо знать внутренний объем везикул, их проницаемость и распределение белка. Для ферментов, катализирующих векторные реакции, молекулы, которые имеют противоположную ориентацию и находятся в одной везикуле, будут работать "вхолостую", компенсируя друг друга при создании результирующего ионного градиента.

Размер везикул. Размер везикул сильно зависит от процедуры реконструкции. Для его определения лучше всего использовать методы электронной микроскопии или гельфильтрации. При удалении детергента диализом образуются протеолипосомы диаметром от 500 до 2500 А в зависимости от белка и используемого метода. При любом способе реконструкции размеры получаемых везикул варьируют в довольно широких пределах; протеолипосомы нужного диаметра можно затем отделить с помощью гельфильтрационной хроматографии.

Распределение белка. Когда при реконструкции используется диализ для удаления детергента из смеси, содержащей избыток ли-пида, распределение белка между полученными везикулами должно подчиняться распределению Пуассона. Однако на самом деле оно может зависеть от встраиваемого белка и методических деталей. Следует отметить, что при спонтанном встраивании в предварительно полученные липосомы некоторые белки включаются преимущественно в везикулы малых размеров. Цитохром bs, например, в 200 раз эффективнее встраивается в везикулы диаметром 200 А, чем 1000 А.

Ориентация белка. Этот вопрос важен с точки зрения энзимологии, поскольку белок, активный центр которого локализован внутри везикулы, может быть недоступен для субстрата. Как ни удивительно, многие ферменты, например цитохром с-оксидаза, Ыа + /К+-АТРаза, глицерол-3-фосфатацил-трансфераза, бактериородопсин, способны встраиваться в мембрану таким образом, что их активный центр с вероятностью 75-95Чо оказывается снаружи везикулы. Везикулы, содержащие цитохром с-оксидазу, с помощью ДЭАЭ-хроматографии удается разделить на две популяции: с активным центром, ориентированным внутрь, и с активным центром, ориентированным наружу. В принципе такой способ разделения пригоден и для других белков.

Причина такой асимметрии встраивания неизвестна. В некоторых случаях ориентированная наружу часть фермента имеет больший размер, а встраивание белка более массивной частью внутрь везикулы невыгодно. Поскольку преимущественная ориентация наблюдается и при встраивании белков в крупные липосомы, по-видимому, асимметрия встраивания не связана с кривизной везикулы, как в случае распределения липидов в везикулах малых размеров. Вероятно, важную роль играют какие-то кинетические факторы, однако их трудно оценить, поскольку неясна природа переходных состояний.

Нельзя не отметить также, что некоторые белки встраиваются в везикулы неправильным образом, т.е. в конформации, отличной от нативной. Наиболее типичный пример - цитохром bs, который в зависимости от метода реконструкции может находиться в одной из двух конформации. Такое поведение характерно также для компонента Н-2К главного комплекса гистосовместимости у мышей и, возможно, для белка оболочки бактериофага Ml 3. Все эти белки имеют один трансмембранный гидрофобный домен, и при некоторых условиях он включается в бислой в U-образной конфигурации, когда N - и С-концевые аминогруппы экспонированы наружу.

Проницаемость. Важность этой характеристики для ферментов, катализирующих перенос веществ или ионов через бислой, несомненна. Многие системы транспорта и ионные насосы изучали после встраивания их в протеолипосомы, и очевидно, что протеолипосомы, пригодные для таких исследований, должны обладать достаточно низкой проницаемостью. Присутствие белка обычно приводит к увеличению проницаемости везикул, но степень этого увеличения очень сильно зависит от выбора липида и от числа молекул белка на везикулу. Высказывалось предположение, что молекулы некоторых липидов благодаря их форме лучше упаковываются вокруг встроенных в бислой белков; тем самым сглаживаются дефекты структуры на границе белок-липид и уменьшается их проницаемость для растворенных веществ. Однако прямые доказательства по этому поводу отсутствуют.

3.1 Влияние липидов на активности мембраносвязанных ферментов

Каталитическая активность многих мембранных ферментов зависит от липидов. Липиды при этом могут выполнять две функции:

1) создавать необходимую среду;

2) действовать как аллостерический регулятор, модулирующий активность фермента. В первом случае липиды не только предотвращают денатурацию ферментов, но и облегчают взаимодействие ферментов друг с другом и с прочими мембраносвязанными компонентами, в частности с ли-пофильными субстратами. В качестве аллостерических эффекторов липиды обычно активируют фермент преимущественно путем стабилизации его в определенной конформации. В принципе две эти функции липидов совершенно различны, однако разграничить их экспериментально бывает крайне трудно. В идеальной экспериментальной системе аллостерическим эффектором должен быть специфический липид, а необходимое для работы окружение фермента должно создаваться всей основной массой липидов в бислое. К сожалению, пока обнаружен только один пример абсолютной специфичности фермента к определенному липиду. /З-Гидроксибутиратде-гидрогеназе для проявления каталитической активности необходим именно фосфатидилхолин, в большинстве же случаев ферменты достаточно эффективно активируются различными липидами. А поскольку любой липид может в той или иной степени выполнять как функцию окружения, так и функцию специфического аллостерического эффектора, различить эти два эффекта становится практически невозможно. На ферментативную активность может влиять также физическое состояние бислоя, в частности поверхностная плотность заряда и вязкость. Систематически подбирая липиды разной структуры и изменяя физическое состояние мембраны, можно установить корреляции между активностью фермента и этим" параметрами, но само по себе такое исследование еще не позволяет разграничить две функции липидов. Изменение физического состояния бислоя может влиять на взаимодействие с ферментом любых липидов, в том числе и тех, которые функционируют как аллостерические эффекторы. При изучении ферментов, субстратом которых служат липофильные соединения, возникают особые проблемы, поскольку такие субстраты должны быть включены в бислои до или после получения везикул, а большие концентрации растворенного в бислое субстрата не могут не сказаться на физическом состоянии модельной мембраны.

Для исследования влияния липидов на мембранные ферменты применяется еще одна стратегия - так называемый метод смешанных мицелл. Фермент растворяют в детергенте, не активирующем его, и к смеси добавляют липиды. Многие мембранные ферменты сохраняют определенную активность и в детергенте, причем такая активность сильно зависит не только от природы фермента, но и от выбранного детергента, а также, возможно, от наличия эндогенных липидов в препарате очищенного фермента. Вообще говоря, для метода смешанных мицелл желательно полностью освободить фермент от липида, однако для этого иногда приходится использовать весьма грубые процедуры, которые могут привести к денатурации белка. Методы полного обезжиривания обычно основаны на пропускании препарата фермента через среду с большим избытком детергента. Для этого используют гель-фильтрацию, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы или связывание фермента с каким-либо твердым носителем с последующим промыванием избытком детергента.

Метод смешанных мицелл имеет еще и то преимущество, что липофильный субстрат можно добавить в мицеллах того же детергента, хотя в этом случае могут возникнуть трудности, связанные с пространственным разделением фермента и субстрата. Наблюдаемые в такого рода системах эффекты липидов являются преимущественно аллостерическими, поскольку здесь нет бислоя, а связывание липидов с белком происходит в глобулярной мицелле в присутствии большого количества детергента. К сожалению, физическое состояние комплекса фермент-детергент-фосфолипид определить практически невозможно, и это серьезный недостаток описываемого подхода.

Любые эффекты, наблюдаемые в такой системе для какого-либо липида, должны быть получены с использованием нескольких не активирующих фермент детергентов. Только в этом случае можно быть уверенным, что детергент нейтрален. К сожалению, такие работы встречаются не часто.

Результаты исследования многих систем позволяют сделать несколько общих выводов.

Для активации фермента очень редко бывает необходим липид с какой-то строго определенной структурой. Безусловно, одни липиды активируют данный фермент с большей эффективностью, чем другие, однако такое предпочтение может зависеть от условий измерения, а уж говорить о его физиологическом значении как минимум преждевременно. Вполне может оказаться, что липид, с высокой эффективностью активирующий фермент, вообще не присутствует в мембране, из которой этот фермент выделен. Поэтому к утверждениям о специфичности липида следует относиться с. осторожностью.

Измеряемая в системе со смешанными мицеллами зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации липида обычно свидетельствует о высокой кооперативности процесса. Такое поведение можно объяснить, в частности, тем, что липиды связываются некооперативио с несколькими эквивалентными центрами на ферменте, но активными являются только те молекулы фермента, у которых занята большая часть липидсвязывающих центров. Нередко при активации фермента липидом наблюдается оптимум в концентрационной зависимости, вероятно связанный с достижением определенного соотношения между липидом и детергентом и образованием в такой смеси конкретных структур.

Сама по себе бислойная структура не является необходимой для активации ферментов, поскольку многие ферменты проявляют активность в присутствии детергента или в составе липидио-детергентных мицелл. Известны случаи, когда мембранные ферменты эффективно активируются липидами, вообще не формирующими стабильные бислои.

Важным параметром, определяющим активность большинства мембранных ферментов, безусловно является физическое состояние бислоя. Однако четких данных о физиологической регуляции ферментативной активности с помощью этого параметра in vivo нет. При переходе липидов в фазу геля многие ферменты становятся неактивными либо их активность резко уменьшается. В литературе есть масса примеров, когда изменения скорости работы фермента с температурой коррелировали с изменением физического состояния липидов. В этих работах основное внимание обращалось на корреляцию между точками перегиба в температурных зависимостях ферментативной активности и какой-либо характеристикой, отражающей физическое состояние липида. Выявить связь ферментативной активности с вязкостью мембраны, исходя из температурной зависимости, весьма непросто, поскольку температура влияет одновременно на очень многие параметры. Следует иметь в виду, что вязкость мембраны в значительной степени коррелирует с плотностью упаковки молекул липида в бислое, и индуцируемые температурой изменения вязкости можно объяснить в основном изменениями в плотности упаковки. Существует очень немного примеров четкой линейной корреляции между активностью фермента и вязкостью мембраны. Неясно, правда, как интерпретировать эту корреляцию с точки зрения механизма ферментативной реакции. И лишь в нескольких работах содержатся указания на то, какая или какие из стадий ферментативной реакции являются лимитирующими и модулируются связыванием липида. В связи с этим необходимо упомянуть, что липиды могут сильно влиять не только на максимальную скорость, но и на связывание фермента с субстратами и кофакторами.

Вообще говоря, при исследовании взаимодействия с определенным ферментом большого числа разных липидов корреляции между активностью фермента и каким-либо одним параметром не наблюдается. Пока липид находится в жидкокристаллическом состоянии, для ферментативной активности часто более важна структура полярной головки липида, чем вязкость бислоя. Другими словами, важна химическая структура индивидуальных липидов, а почему - это уже отдельный вопрос.

4. Некоторые примеры липидзависимых ферментов

Рассматриваемые ниже пять ферментов выбраны в качестве примеров потому, что, во-первых, они лучше всего изучены и охарактеризованы; во-вторых, они охватывают несколько типов мембранных ферментов; в-третьих, они могут служить иллюстрацией нескольких основных проблем, возникающих при исследовании липидзависимой активации.

4.1 0-гидроксибутиратдегидрогеназа

Это один из наиболее хорошо изученных активируемых липидом ферментов и единственный фермент, обладающий абсолютной специфичностью к определенному липиду: активировать БДГ способен только фосфатидилхолин. БДГ локализуется на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны и катализирует окисление /3-гидроксибутирата с помощью NAD+. Оба субстрата водорастворимы. Молекулярная масса субъединицы фермента равна 31 кДа, но ее аминокислотная последовательность до конца не установлена. БДГ скорее всего не является трансмембранным белком. Получаемый после очистки фермент свободен от фосфолипида и детергента и способен спонтанно встраиваться в фосфолипидные везикулы. Хотя БДГ связывается и с везикулами, не содержащими Фосфатидилхолина, каталитическую активность фермент начинает проявлять только в присутствии фосфатидилхолина. При встраивании фермента в везикулу, по-видимому, происходит не только взаимодействие с поверхностью мембраны, но и значительное погружение белка в бислой, а также изменения конформации белка. Кинетические свойства фермента и его тетрамерной формы одинаковы в митохондральной мембране и после реконструкции с митохондриальными липидами.

На Рис.6.2 приведена кривая активации БДГ фосфолипидными везикулами, содержащими разное количество фосфатидилхолина. Во всех случаях фермент встроен в липосомы. Зависимость скорости ферментативной реакции от содержания фосфатидилхолина в бислое указывает на высокую кооперативность процесса, в котором участвуют два необходимых для активации липидсвязывающих центра.

Кроме того, по данным о тушении флуоресценции триптофана производными фосфатидилхолина отдельно была определена доступность молекул фосфатидилхолина для БДГ. Степень тушения флуоресценции фактически является мерой связывания липида. Оказалось, что фосфатидилхолин связывается некооперативно с примерно 12 центрами в молекуле фермента. Такое некооперативное связывание с довольно большим числом центров весьма типично для мембранных белков в бислое. Кроме того, основная часть флуоресценции тушится при более низких концентрациях фосфатидилхолина, чем необходимо для активации. Такое расхождение между связыванием липида и активацией фермента можно объяснить, если предположить, что в активации участвует только очень небольшая часть центров, которые не удается выявить в экспериментах по тушению флуоресценции. Приведенные результаты интересны еще и тем, что позволяют сопоставить физическое взаимодействие определенного липида и фермента с биохимическим ответом.

Интерпретация результатов таких экспериментов осложняется тем, что активность фермента может сильно зависеть от степени его агрегации, т.е. активность фермента в различных липидах, по-видимому, будет соответствовать степени его дезинтеграции. БДГ замечателен еще и тем, что это один из немногих ферментов, активируемых короткоцепочечными гомологами фосфатидилхолина, которые связываются с ферментом и активируют его в концентрациях ниже критической концентрации мицеллообразования. Эти данные тоже подтверждают, что в активацию липидом вовлечено только небольшое число центров связывания на белке.

Страницы: 1, 2, 3, 4

Голосование

Как вы оцениваете работу нашего сайта? Отлично Хорошо Нормально Плохо Результаты