Як видно, значення активаційного бар'єру U (Табл. 1) є близькими для всіх об'єктів. Крім того, ці значення потрапляють в інтервал від 10 до 20ккал/моль, характерний для активаційного бар'єру процесу денатурації різних білків. Отже, можна припустити що це є одна і та ж величина і що бар'єр інактивації U різних мікроорганізмів визначається процесом, що не пов'язаний з їхнім розміром, масою або формою.
Значення зміни питомого об'єму ДV для всіх об'єктів (Табл. 1) за порядком величини збігаються з характерними значеннями ДV для білків. Таким чином підтверджується припущення, що інактивація мікроорганізмів обумовлена деградацією білків. Величини ДV для різних вегетативних форм приблизно однакові. Теж саме маємо і для спор, при цьому ДV для спор помітно менше, ніж для вегетативних форм. Цей факт також підтверджує зв'язок інактивації мікроорганізмів з деградацією білків, оскільки в спорах упаковка білків є більш щільною і в них відсутні або є в мінімальній кількості порожнини, які заповнюються водою при розгортанні білка і дають вагомий внесок у зміну об'єму зразка.
Отримані в роботі експериментальні дані досить добре описуються в рамках кінетичної моделі першого порядку, одначе, в літературі часто зустрічаються дані зі значними відхиленнями від лінійності, які зазвичай описуються комбінацією двох реакцій першого порядку як двофазна кінетика з різними швидкостями інактивації. Зміна порядку реакції іноді спостерігається у межах одного виду бактерій і навіть у межах однієї серії дослідів, що зазвичай пояснюється існуванням невеликої частини популяції з підвищеним опором до впливу високого тиску, «багатофазністю» процесу інактивації або зміною порядку реакції. В дисертації показано, що цей ефект є пов'язаним з нерівномірним остиганням зразку, який нагрівається внаслідок стискання. При адіабатичному стисканні під тиском до 600МПа константа швидкості інактивації може збільшуватися для різних об'єктів від 2 до 5 разів у залежності від співвідношення W/kT.
Вирівнювання температури у зразку, що стискається, описується нестаціонарним рівнянням теплопровідності. Аналіз показує, що характерний час експоненціального остигання ф залежить від конструкції барокамери та не залежить від ступеню нагріву. Оцінка часу остигання дає ф~10хв, що влучає в область звичайних експозицій (від 5 до 30хв). Таким чином, при знятті кінетичної кривої дослідники неминуче охоплюють як область t < ф, так й t > ф. При t < ф температура біля середини зразка вища, ніж на периферії. При t > ф температура вирівнюється, середня по об'єму швидкість реакції падає, що й спостерігається як нова «фаза з підвищеною опірністю тиску». Можливість фіксації цієї фази у досліді залежить, насамперед, від величини зміни температури, яка визначається як величиною самого тиску, так і часом його зростання порівняно з ф.
Урахування нерівномірного остигання стиснутого зразка здійснювалось через усереднення по об'єму рішення лінійного кінетичного рівняння, в якому константа швидкості реакції визначається за формулою Ареніуса (3) з неоднорідним розподілом температури
,(5)
де - рішення нестаціонарного рівняння теплопровідності, безрозмірний розподіл температури в одиницях її максимального перевищення над початковою, що задається величиною адіабатичного нагрівання при стисненні вP (для води в=3єC/100МПа). Початок відліку часу t=0 відповідає закінченню підвищення тиску.
При урахуванні нерівномірного остигання криві залежності ступеню деградації біооб'єктів від тиску (Рис. 1) змінюються незначно. Граничне значення тиску, при якому спостерігається різкий спад концентрації, зрушується в сторону менших тисків на 20 і 10МПа для t=10 й 20хв відповідно. З ростом часу обробки виправлення на нагрівання зменшується за рахунок зменшення середньої температури, при якій відбувається інактивація. Ґрунтуючись на отриманих результатах у роботі відкинуто сумнівні припущення, які робляться для пояснення особливостей кінетики цих процесів. З іншого боку, той факт, що лінійна кінетична модель здатна описати спостережувані на експерименті відхилення від лінійності є підтвердженням адекватності цієї моделі.
Розглянуто зростання кислотності під тиском як фактор інактивації мікроорганізмів. Аналіз літератури показує, що концентрація іонів водню визначає межі існування живої матерії. Багато експериментальних робіт доводять, що кислотність харчового середовища істотно впливає на ступінь інактивації мікроорганізмів високим тиском. Отримані і співставленні у даній роботі експериментальні і розрахункові криві для яблучного пюре і вишневого соку (Рис. 3) підтверджують факт росту швидкості інактивації мікроорганізмів під тиском за знижених рН. Величина зрушення збігається з літературними даними, згідно з якими кислотність харчових продуктів збільшується під дією тиску від 0.2 до 0.5 одиниць рН на кожні 100МПа. На відміну від мікроорганізмів вітамін С стабілізується при підвищенні кислотності середовища. Результати вимірів впливу тиску на зміст вітаміну С у середовищах різної кислотності (Рис. 2) показують, що більша деградація вітаміну С спостерігається у розчинах з більшим рН. Той же ефект дає збільшення часу обробки. Зростання кислотності харчових продуктів з підвищенням тиску пояснюється добре вивченим ростом дисоціації молекул води при підвищенні тиску й температури. В роботі показано, що збільшення тиску на 100МПа зменшує pH приблизно також, як збільшення температури на 10єC. Таким чином збіг змін показника pH в інтервалах температури 60-100єC та тиску 500-1000МПа, які стерилізують продукти харчування, не є випадковим і саме зміна pH з ростом як температури, так і тиску приводить до денатурації білків і, відповідно, до інактивації мікроорганізмів. Інактивуюча дія високого тиску зумовлена, в основному, зміною рН середовища, а інактивація клітини є вторинним ефектом.
Спираючись на отримані результати доведено, що механізмом впливу тиску на мікроорганізми є денатурація білків. Денатурація білків при нагріванні й втрата ними біологічної активності пов'язані з розривом сітки з молекул води, яка обмежує або стримує вібраційну динаміку білка. Необхідна для розриву енергія визначає розмір бар'єру U для переходу з нативного в активований стан N > A#. Показником міцності сітки водневих зв'язків може служити кислотність середовища, оскільки, як доведено у роботі, вона впливає на швидкість інактивації. Величина рН знижується з ростом температури й тиску.
Вільна енергія реакції денатурації білка ДGtotal формується (див. Рис. 5(а)) спільними ефектами згортання/розгортання та зміни ступеня гідратації неполярних і полярних груп білка. Ці внески значною мірою компенсують один одного, так що вільна енергія стабілізації типового білка становить усього 10-20ккал/моль, тоді як зміни ентальпії ДHnonpolar й ДHpolar (і помножені на температуру зміни ентропії TДSnonpolar й TДSpolar) можуть розрізнятися більш, ніж на ±120ккал/моль. Там, де ДGtotal<0, спостерігається теплова (при T>T2) і холодова (при T<T1) денатурація, що у залежності від умов експерименту може протікати швидко або дуже повільно. Область існування нативного стану T1<T<T2 визначає температурний оптимум щодо активності білка.
На Рис. 5(б) проілюстровано залежність стабільності білка від тиску. Область тисків вище деякого критичного значення P>Pc відповідає денатурованому стану білка. Швидкість денатурації в цій області визначається величиною активаційного бар'єру, доданок U у якому пов'язаний з розривом сітки водневих зв'язків і є однаковим для термо- і бароденатурації. Вплив тиску на швидкість денатурації визначається сумарною зміною об'єму зразка. Область існування нативного стану P<Pc відповідає оптимуму активності білка під тиском, Pc є істотно меншим, ніж граничні значення інактивації (~500МПа для більшості мікроорганізмів).
Практичними наслідками дисертаційної роботи є можливості оптимізації параметрів стерилізації біооб'єктів та стандартизації обробки високим тиском. Запропонована модель дозволяє передбачити поводження досліджених об'єктів при різних сполученнях параметрів обробки: тиску, температури і тривалості їхньої дії. Як приклад у роботі наведено ряд номограм, розрахованих для вибору параметрів впливу на вишневий сік, що зменшує в 106 разів концентрацію МАФАМ і цвілі. Показано, що для порівнянного зменшення концентрації вітаміну С величина тиску повинна бути на порядок вище. Номограми призначені для вибору тиску P і температури T при заданих термінах обробки t або для вибору тиску P і терміну обробки t при заданих температурах T.
Наразі відсутні загальноприйняті критерії, що визначають якість обробки тиском харчових продуктів. Ґрунтуючись на отриманих результатах, в дисертації запропоновано використовувати усереднені термодинамічні характеристики мікрофлори ln(A), U й ДV як контрольні параметри при розробці процедури стандартизації обробки продуктів високим тиском.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі експериментально досліджено закономірності та розроблена фізико-математична модель спільної дії високого тиску і температури на мікроорганізми і вітамін С у різних середовищах, вивчено мікроскопічний механізм впливу тиску на біосистеми. Отримані результати можуть бути використані для подальшого розвитку баробіології та нової технології стерилізації харчових продуктів високим тиском.
Основні результати сформульовано наступним чином.
1. Показано, що основні закономірності спільної дії факторів високого тиску, температури й часу витримки на мікроорганізми й вітамін С відтворюються в рамках лінійної кінетики. При виборі параметрів обробки (тиску, температури і тривалості їхньої дії), а також при виробленні нових стандартів доцільно використовувати усереднені термодинамічні характеристики мікрофлори - передекспоненційний множник A, величину активаційного бар'єру реакції U та зміну об'єму ДV.
2. Встановлено, що тиск порядку 500МПа є граничним для інактивації виявлених мікроорганізмів, у той час як вміст вітаміну С при цьому змінюється незначно - від 10% при T=25C й t=10хв до 50% при T=45C й t=20хв, що є значно меншим, ніж втрати вітаміну С у результаті теплової стерилізації, які становлять 80% при T=100C і тривалості обробки 10 хвилин.
3. Показано, що відхилення кінетики інактивації мікроорганізмів від залежності, що є характерною для хімічної реакції першого порядку, пояснюється нерівномірністю остигання зразка, який нагрівається внаслідок стискання. Ці відхилення зростають з ростом величини тиску і швидкості його нагнітання. Залежність часу остигання від геометрії камери стиску пояснює розкид даних з різних лабораторій.
4. Зменшення граничного тиску для інактивації МАФАМ на 150МПа в яблучному пюре з pН=5.4 у порівнянні з вишневим соком з pН=6.1 пов'язано з впливом кислотності середовища на ступінь інактивації під тиском. Зростання кислотності середовища, що відбувається внаслідок підвищення тиску, прискорює інактивацію. Однакові для багатьох мікроорганізмів значення тиску ~500МПа (при 25C) або температури ~60C (при нульовому тиску), що є критичними для стерилізації, викликають однакове зниження pН і відповідають виходу біосистеми за межі кислотного оптимуму.
5. Збіг винайдених значень активаційного бар'єру U для всіх досліджених мікроорганізмів доводить, що інактивація визначається процесом, який не є пов'язаним з їхнім розміром, масою або формою. Близькість значень зміни питомого об'єму ДV до характерних значень ДV для білків підтверджує обумовленість інактивації мікроорганізмів деградацією білків.
6. Механізм впливу тиску на мікроорганізми визначається конкуренцією внесків у вільну енергію денатурації від розгортання полярних і неполярних груп внутрішньої частини білкової глобули. Утворення активованого стану пов'язане з відкриттям доступу води у внутрішні порожнини білка.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1. Шаталов В.М., Нога И.В., Сукманов В.А., Петрова Ю.Н., Соколов С.А., Жданов И.В., Волкова А.В. Оптимизация параметров обработки продуктов питания сверхвысоким давлением // Проблемы экологии и охраны природы техногенного региона: Межведомственный сборник научных работ. - Донецк, 2003. - N.3. - C.238-247.
2. Нога И.В., Шаталов В.М., Сукманов В.А. Кинетика деградации биомолекул под действием высокого давления и температуры // Физика и техника высоких давлений. - 2004. - T.14, N.2. - C.74-85.
3. Борисенко И.Н., Ветрова Е.В., Нога И.В., Панфилова Е.Г., Шаталов В.М. Инактивация микроорганизмов в яблочном пюре под действием высокого давления // Вісник Донецького університету, сер. А: Природничі науки. - 2006. - N 2. - С.375-377.
4. Нога И.В. Термодинамика воздействия высокого давления и температуры на микроорганизмы и витамины // Физика и техника высоких давлений. - 2006. - T.16, N.3. - C.126-136.
5. Нога И.В., Шаталов В.М. Причины нелинейности в кинетике инактивации микроорганизмов под давлением // Біофізичний вістнік. - 2007. - Вип. 18 (1). - С. 90-95.
6. Нога И.В., Шаталов В.М. Рост кислотности среды под давлением как фактор инактивации микроорганизмов // Физика и техника высоких давлений. -2007. - T.17, N.2. - C.131-137.
7. Нога И.В., Шаталов В.М. Моделирование кинетики инактивации спор Bacillus subtilis и Bacillus stearothermophilus // Біофізичний вістнік. - 2007.- Вип. 19 (2). - С. 116-121.
8. Нога И.В., Шаталов В.М., Сукманов В.А. Моделирование воздействия давления и температуры в процессах стерилизации продуктов питания сверхвысоким давлением // Прoблеми бiологiчної і медичної фізики: І Українська наукова конференція з міжнародним представництвом. Xapків, 20-23 верес. 2004 р. - Xapків, 2004. - C.197-197.
9. Шаталов В.М., Нога И.В., Волкова А.В., Сукманов В.А. Сохранение витамина С в процессах пастеризации продуктов питания сверхвысоким давлением // Харчові добавки. Харчування здорової людини: І міжгалуз. Міжнар. Конф. Донецьк, 8-9 квіт. 2005р. - Донецьк, 2005. - С.249-251.
10. Волкова А.В., Нога И.В. Сохранение витамина С в процессах пастеризации продуктов питания сверхвысоким давлением // Охорона навколишнього середовища та раціональне використання природних ресурсів: Міжнар. наук. конф. асп. та студ. Донецьк, 12-14 квіт. 2005 р. - Донецьк, 2005. - Т.2. - С.174-175.
11. Нога И.В., Шаталов В.М. Стерилизация сверхвысоким давлением // Достижения, проблемы и перспективы культивирования грибов. Современные технологии: Междунар. науч.-практ. конф. Донецк 29 сент.-2 окт. 2005г. - Донецк, 2005. - C.55-58.
12. Беспалова С.В., Нога И.В., Сукманов В.А., Шаталов В.М. Изучение действия высокого давления и температуры на некоторые микроорганизмы и витамины // Матеріали IV з'їзду українського біофізичного товариства Донецьк, 19 - 21 грудня 2006 р. - Донецьк, 2006. - С.331-332.
13. Нога И.В., Шаталов В.М. Термодинамический анализ деградации биосистем под действием высокого давления и температуры // Высокие давления - 2006: 9-я междунар. конф. Судак, 17-22 сент. 2006 г. - Донецк, 2006. - С.152.
14. Нога И.В., Шаталов В.М. Изменение pH под давлением как фактор инактивации микроорганизмов // Матеріали IV з'їзду українського біофізичного товариства Донецьк, 19-21 грудня 2006 р. - Донецьк, 2006. - С.354-355.
15. Нога И.В., Шаталов В.М. Изучение механизма действия высокого давления и температуры на некоторые микроорганизмы и витамины //Актуальные вопросы теоретической и прикладной физики и биофизики. «Физика. Биофизика - 2007»: ІІІ Всеукраин. науч.-техн. конф. г. Севастополь, 23-28 апр. 2007 г. - Севастополь, 2007. - С.135-137.
16. Борисенко И.Н., Нога И.В., Панфилова Е.Г. Действие высокого давления на микроорганизмы в яблочном пюре // Охорона навколишнього середовища та рацiональне використання природних ресурсов: VI Міжнар. наук. конф. асп. та студ. Донецьк, 17-19 квiт. 2007р. - Донецьк, 2007. - С.160-161.
АНОТАЦІЯ
Нога І.В. Механізм дії високого тиску і температури на деякі мікроорганізми та вітаміни. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата фізико-математичних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, Харків, 2008.
Робота присвячена науковому обґрунтуванню створення фундаментальних основ нової технології стерилізації продуктів харчування високим тиском. Із цією метою досліджені механізми інактивації мікроорганізмів і деградації вітамінів під дією тиску (до 600МПа) і температури (до 60°С). Методи- експериментальне дослідження та фізико-математичне моделювання кінетики деградації вітамінів і інактивації мікроорганізмів під дією тиску, температури й інших факторів. Показано, що тиск ~500МПа є граничним для інактивації більшості мікроорганізмів, у той час як зміст вітаміну С змінюється незначно. Кінетика інактивації мікроорганізмів і деградації біомолекул цілком задовільно відтворюється в рамках хімічної реакції першого порядку. Високий тиск та підвищена температура збільшують кислотність середовища. Зрушення кислотності обумовлює денатурацію білків, що, в остаточному підсумку, приводить до інактивації мікроорганізмів. Мікроскопічний механізм впливу тиску на мікроорганізми визначається відкриттям доступу води у внутрішні порожнини білків. Результати роботи можуть бути використані при виборі оптимальних параметрів обробки продуктів високим тиском для забезпечення стерильності продукту й збереження його харчосмакових якостей з мінімальними витратами енергії й часу, а також для розробки відсутніх на даний момент стандартів у технології обробки продуктів харчування надвисоким тиском.
Ключові слова: високий тиск, кінетика, інактивація, мікроорганізми, денатурація, білки.
SUMMARY
Noga I.V. Mechanism of the high pressure and temperature impact on some microorganisms and vitamins. - Manuscript.
Thesis for a candidate degree of physical and mathematical sciences by specialty 03.00.02 - biophysics. - Kharkiv National University, Kharkiv, 2008.
The work is devoted to creation of a fundamental base of technology of sterilization of food by the high-pressure treatment. With this purpose microorganism inactivation mechanisms and degradation of vitamins under action of pressure (up to 600МПа) and temperatures (up to 60°С) are researched. Methods of research - experimental supervision and mathematical modeling of degradations of vitamins and microorganism inactivation kinetics under action of pressure, temperatures and other factors. It is shown, that pressure ~500MPa is boundary for inactivation of the majority of microorganisms while the content of vitamin C thus varies slightly. Microorganism inactivation kinetics and degradation of biomolecules it is quite well described within the first order chemical reaction. The high pressure and temperature increase the acidity. The shift of acidity causes protein denaturation that, finally, leads to inactivation of microorganisms. The microscopic mechanism of influence of pressure upon microorganisms is determined by opening of access of water in internal cavities of proteins. Results of work can be used to optimize the set of parameters of the high pressure processing of products which give maintenance of sterility of a product and preserve its flavor qualities with the minimal expenses of energy and time, and also for development of the high pressure processing technology standards which are absent at the present time.
Keywords: high pressure, inactivation, kinetics, microorganisms, unfolding, protein.
АННОТАЦИЯ
Нога И.В. Механизм действия высокого давления и температуры на некоторые микроорганизмы и витамины. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина, Харьков, 2008.
Работа посвящена научному обоснованию создания фундаментальных основ технологии стерилизации продуктов питания высоким давлением. С этой целью исследуются механизмы инактивации микроорганизмов и деградации витаминов под действием давления и температуры.
Цель работы - экспериментально выявить основные закономерности и разработать физико-математические модели совместного действии на биосистемы факторов высокого давления, температуры и времени выдержки. Методы исследования - экспериментальное исследование и физико-математическое моделирование кинетики деградации витаминов и инактивации микроорганизмов под действием давления и температуры.
В работе предполагается, что при высоких давлениях и температурах возникают некоторые первичные нарушения на молекулярном и межмолекулярном уровнях, которые индуцируют последующие изменения и регулируются общими термодинамическими соотношениями. Кинетика этих процессов описывается феноменологически с учетом таких термодинамических параметров, как активационный барьер реакций, изменение молярного объема и т.п. Процессы, приводящие к первичным нарушениям, подчиняются общим термодинамическим законам, поскольку охватывают огромное число межмолекулярных столкновений. Такое рассмотрение проблемы обработки пищевых продуктов сверхвысокими давлениями на основе биофизических подходов является новым.
В процессе решения задачи поиска общих характеристик, описывающих воздействие давления, температуры и времени обработки на различные составные части пищевых продуктов - витамины, микроорганизмы и пр., впервые проведено комплексное экспериментальное исследование. Для отделения неучтенных эффектов среды впервые была предложена и реализована концепция модельных экспериментов, в которых пищевая среда имитируется буферным раствором с заданным рН. Впервые действие давления, температуры и времени выдержки на обрабатываемые продукты объединены в рамках одной модели. Разработана методика определения параметров этой модели. В рамках той же модели получено описание кинетики деградации витамина С. Впервые предлагается микроскопический механизм воздействия давления на микроорганизмы, основанный на сравнении барьеров инактивации и изменений молярного объема для различных микроорганизмов. На основе полученных результатов в работе разработан новый физически обоснованный подход к стандартизации процесса обработки продуктов высоким давлением, а также способ оптимизации параметров обработки. Созданы научные предпосылки для разработки приоритетного направления «Производство экологически чистых продуктов и технологии их хранения».
Выводы. Давление ~500 МПа является граничным для инактивации большинства микроорганизмов, в то время как содержание витамина С при этом меняется незначительно. Кинетика инактивации микроорганизмов и деградации биомолекул вполне удовлетворительно воспроизводится в рамках химической реакции первого порядка. Высокое давление и повышенная температура увеличивают кислотность среды. Сдвиг кислотности обуславливает денатурацию белков, что, в конечном итоге, приводит к инактивации микроорганизмов. Микроскопический механизм воздействия давления на микроорганизмы определяется открытием доступа воды во внутренние полости белков.
Результаты работы могут быть использованы при выборе оптимальных параметров обработки продуктов высоким давлением для обеспечения стерильности продукта и сохранения его пищевкусовых качеств с минимальными затратами энергии и времени, а также для разработки отсутствующих на данный момент стандартов в технологии обработки продуктов питания сверхвысоким давлением.
Ключевые слова: высокое давление, инактивация, кинетика, микроорганизмы, денатурация, белки.
Страницы: 1, 2
