Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Обнаружение единичных нуклеотидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Введение

Методы обнаружения нуклеотидных замен в геномной ДНК позволили исследователям разобраться в природе многих наследственных болезней человека. Эти методы дают возможность идентифицировать специфические мутации, приводящие к заболеванию, а также полиморфные участки ДНК, используемые в качестве маркеров в генетическом анализе. Благодаря развитию методов выявления нуклеотидных замен стала реальностью пренатальная диагностика многих наследственных болезней человека. Если ген, отвечающий за заболевание, известен, соответствующую мутацию можно обнаружить в геномной ДНК или в РНК при помощи блот-гибридизации с использованием меченых олигонуклеотидов в качестве гибридизационных зондов. В том случае, когда мутировавшая нуклеотидная последовательность неизвестна, замены нуклеотидов можно определить по полиморфизму длины рестрикционных фрагментов. ПДРФ обнаруживается по наличию или отсутствию сайта рестрикции во фрагменте геномной ДНК при гибридизации меченого ДНК-зонда с обработанной рестриктазами геномной ДНК, расфракционированной по размеру в агарозном геле и перенесенной на мембранный фильтр. Этот метод оказался очень эффективным для выявления как значимых мутаций, так и нейтрального полиморфизма в геноме человека и других организмов. Однако большую часть мутаций и полиморфных участков генома не удается обнаружить с помощью анализа ПДРФ, поскольку вероятность того, что замена нуклеотида изменит именно сайт рестрикции, низка. Так, например, многие точковые мутации гена р-глобина человека, вызывающие талассемию, не изменяют сайтов рестрикции, а потому не могут быть непосредственно определены прн анализе ПДРФ. Кроме того, оказалось, что в некоторых участках генома млекопитающих полиморфизм незначителен, что крайне затрудняет выявление в них ПДРФ даже при использовании большого числа различных рестриктаз. Каждый из них позволяет идентифицировать по крайней мере 50% всех возможных замен нуклеотидов на участке ДНК Длиной до 1000 п.н.

Задача настоящей работы - подробно изложить суть новых методов, обсудить их преимущества и недостатки, рассмотреть некоторые модификации. Кроме того, мы на примерах покажем, как можно использовать предложенные нами методы для исследования фрагментов ДНК, полученных при амплификации специфических последовательностей в ходе полимеразной цепной реакции.

1. Общее описание методов

1.1 РНКазное расщепление

Единичные нуклеотндные замены во фрагментах геномной ДНК можно обнаружить при расщеплении неспаренных участков в РНК-ДНК-дуплексах, обрабатывая эти дуплексы РНКазой А. Рис. 1 иллюстрирует последовательные этапы процедуры.

1. Синтез равномерно меченного одноцепочечного РНК-зонда с использованием транскрипции in vitro клонированного фрагмента ДНК.

2. Гибридизация зонда с комплементарными последовательностями геномных ДНК - Если в гибриднзуемой ДНК имеется замена нуклеотида, образующие РНК-ДНК-дуплексы содержат однонуклеотндные неспаренные участки.

3. Обработка дуплекса РНКазой А, приводящая к расщеплению цепи РНК по многим, хотя и не по всем, неспаренным нуклеотидам.

4. Анализ меченых фрагментов РНК при помощи денатурирующего гель-электрофореза с последующей радиоавтографией. В этом случае эффективное расщепление по неспаренным основаниям приводит к появлению на радиоавтографах двух меченых фрагментов РНК, размеры которых указывают на положение нуклеотидной замены относительно концов фрагмента ДНК. Одиночный меченый фрагмент РНК, равный по длине фрагменту ДНК, наблюдается в том случае, если в последнем нет нуклеотидных замен или если существующие замены препятствуют расщеплению РНК-ДНК-Дуплекса РНКазой.

На рис. 2 в качестве примера представлены результаты реакций РНКазного расщепления. При такой обработке расщепляется примерно 30-40% от общего числа неспаренных участков в РНК-ДНК-дуплексе. Тестирование фрагмента ДНК в двух независимых реакциях РНКазного расщепления с двумя зондами, комплементарными каждой из его цепей, позволяет выявить в нем 60-70%: всех возможных замен нуклеотидов, так как в этом случае обнаруживаются даже комплементарные замены в обеих цепях.

Оптимальными, на наш взгляд, являются РНК-зонды и соответственно исследуемые на однонуклеотидные замены участки ДНК длиной от 100 до 1000 нуклеотидов. В этом случае и сам зонд, и продукты его расщепления легко выявляются при помощи денатурирующего гель-электрофореза в полиакриламидном геле, аналогичном используемому при секвенировании ДНК. При этом отношение сигнала к фону достаточно высоко для получения четких результатов. Совсем нетрудно наработать меченые одноцепочечные РНК-зонды гораздо большей длины, но результаты обработки таких длинных цепей РНКазой неоднозначны. Еще одна проблема, которая возникает при использовании зондов с длиной цепи более 1000 п.и., заключается в том, что под действием РНКазы наряду с расщеплением РНК-ДНК-дуплексов по неспаренным участкам может происходить расщепление цепи РНК по комплементарно спаренным участкам дуплекса. Кроме того, анализ продуктов расщепления длинных РНК-зондов требует проведения денатурирующего электрофореза в агарозном геле. При этом в ряде случаев не удается полностью разделить гибриды РШ-ДШ и результаты получаются противоречивыми, так как фрагменты РНК, полученные при расщеплении ее по неспаренным участкам, но оставшиеся связанными с ДНК, обнаруживаются в геле в зонах, соответствующих длине всего зонда. Для более эффективного выявления единичных нуклеотидных замен путем РНКазного расщепления мы использовали по несколько зондов в каждой реакции отжига / расщепления. Однако полученные таким способом результаты зачастую очень неоднозначны и с трудом поддаются интерпретации. В силу перечисленных причин при исследовании фрагментов ДНК на единичные замены мы бы рекомендовали использовать в реакциях РНКазного расщепления РНК-зонды длиной от 100 до 1000 нуклеотидов.

Показано, что рибонуклеаза может расщеплять неспаренные участки и в дуплексах РНК-РНК. По данным Перучо, единичные мутации в H-ras-гене выявляются при расщеплении неспаренных участков дуплекса РНК-РНК, образованного мРНК гена H-ras и его «антисмысловой» мРНК. Наши исследования показали, что естественные мутации в гене р-глобина и искусственные мутации в промоторном участке гена р-интерферона можно обнаружить при РНКазном расщеплении как РНК - ДНК-, так и РНК-РНК-дуплексов. На клонированной ДНК-матрице мы получали равномерно меченные одноцепочечные зонды «антисмысловой РНК», ренатурировали их с комплементарной мРНК, обрабатывали образовавшиеся дуплексы РНКазой, а затем идентифицировали продукты расщепления денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле. Поэтому приведенные ниже методики для исследования образцов ДНК с равным успехом могут использоваться и при работе с РНК.

1.2 Денатурирующий градиентный гель-электрофорез

Два фрагмента ДНК, различающиеся лишь делецией, инсерцией или заменой одного нуклеотида, или единственным неспаренным нуклеотидом, можно легко разделить при помощи денатурирующего градиентного гель-электрофореза, ДГГЭ. Принцип метода заключается в разделении двухцепочечных фрагментов ДНК электрофорезом в стандартном акриламидном геле с линейным градиентом денатурирующих факторов - мочевины, формамида или температуры. Ниже приводятся теоретические основы метода. Здесь отметим только, что разделение очень похожих фрагментов в геле происходит из-за разных температур плавления их ДНК.

1.2.1 Теоретические основы метода ДГГЭ

При постепенном повышении температуры или концентрации денатурирующего вещества происходит плавление двухцепочечной ДНК, и для каждого фрагмента параметры этого процесса различны. Внутри фрагмента имеются так называемые области плавления - блоки последовательностей, плавящихся одновременно при определенных дискретных значениях температуры, которая и является температурой плавления данной области. Длина таких областей составляет от 25 до нескольких сотен нуклеотидных пар. Два соседних домена могут иметь четкую границу и различаться по Гт на несколько градусов. Фрагменты ДНК длиной 100-1000 п.н. имеют обычно от двух до пяти областей плавления. Температура плавления доменов в рестрикционных фрагментах большинства образцов ДНК из природных источников колеблется от 65 до 80°С.

Общеизвестно, что нуклеотидный состав фрагментов ДНК влияет на температуру их плавления. Оптимальные условия для отжига и отмывки нуклеиновых кислот в реакциях гибридизации подбирают исходя из их нуклеотидного состава. В гораздо меньшей степени учитывается вклад стэкинг-взаимодействий в термодинамическую стабильность двойной спирали. А между тем энергия таких взаимодействий между соседними нуклеотидами одной цепи ДНК, удерживающих ее в скрученном состоянии в физиологических растворах, больше энергии водородных связей комплементарного спаривания. Порядок чередования оснований определяет степень стэкинга и, следовательно, влияет на термостабильность фрагмента ДНК. Даже единичная нуклеотидная замена может так сильно сказаться на стэкинг-взаимодействий, что Гт изменится более чем на 1°С. Поскольку процесс плавления домена практически полностью определяется кооперативными взаимодействиями, любая единичная нуклеотидная замена в любой его точке будет менять температуру плавления,

Разработанный Лерманом и Фишером метод электрофоретического разделения близких последовательностей ДНК основан на использовании различий в температуре плавления, обусловленных нуклеотидными заменами. Они исходят из того факта, что последовательность оснований влияет на Тт области плавления и что конформация фрагмента ДНК обусловливает его подвижность в геле под действием электрического поля. Принцип метода - электрофорез ДНК в акриламидном геле фиксированной концентрации с линейно возрастающим к нижней части геля градиентом концентрации веществ, денатурирующих ДНК: обычно мочевины или формамида. Электрофорезная камера нагревается до температуры примерно 60°С.

Это чуть ниже температуры плавления самой легкоплавкой области во фрагменте ДНК - двухцепочечная молекула ДНК входит в гель и продвигается в нем со скоростью, пропорциональной ее молекулярной массе. Как только фрагмент достигает участка геля, в котором температура камеры и концентрация денатурирующих веществ создают условия для плавления первой, самой легкоплавкой области, он как бы разветвляется: одна часть его остается двухцепочечной, а другая переходит в одноцепочечную форму. Такая разветвленная структура застревает в порах геля, в результате чего ее подвижность снижается. Снижение электрофоретической подвижности молекулы коррелирует с соотношением длин денатурированного и двухцепочечного участков: чем длиннее самый легкоплавкий домен, тем сильнее снижается подвижность. Участок геля, в котором молекула ДНК начинает терять скорость, соответствует самым легкоплавким доменам. Если концентрации денатурирующих веществ подобраны правильно, то два фрагмента ДНК, различающиеся лишь одной нуклеотидной заменой и имеющие неодинаковые значения Тт., начнут снижать скорость в различных участках геля, и к концу прохождения через него их легко будет разделить. Ранее считалось, что отделить мутировавшие фрагменты от фрагмента ДНК дикого типа за счет разной степени снижения их подвижности в ДГГЭ можно лишь в том случае, если замены произошли в области с самым низким значением Тт. Однако анализ большого числа образцов ДНК, а также последующие теоретические выкладки показали, что в большинстве случаев метод ДГГЭ дает возможность обнаружить нуклеотидные замены во всех областях плавления, за исключением самых термостабильных. Замены в областях с самой высокой температурой плавления обычно не обнаруживаются, так как по окончании плавления последнего домена ДНК полностью денатурирует, а это приводит к нарушению корреляции между конформацией молекулы и скоростью ее продвижения. Важно помнить, что успех при проведении ДГГЭ с целью разделения мутировавшего фрагмента и фрагмента ДНК дикого типа определяется структурой фрагмента. Она должна быть разветвленной, причем мутации должны приходиться на области, подвергшиеся плавлению. Для увеличения разрешающей способности метода к исследуемому фрагменту ДНК «пришивали» последовательность с более высокой температурой плавления ДНК, так называемый «GC-зажим». При этом все области плавления фрагмента, включая самую тугоплавкую, становились доступными для анализа. Эти опыты проводили с препаратами ДНК, клонированными в плазмидном векторе, содержащем «GC-зажим». Чтобы избежать стадии клонирования, фрагменты с «зажимами» можно получить в полимеразной цепной реакции.

Еще одним усовершенствованием ДГГЭ следует считать использование гетеродуплексных фрагментов, образованных мутировавшей ДНК и ДНК дикого типа. В предыдущих опытах сравнивали подвижность гомодуплексных фрагментов мутантной и исходной ДНК в параллельных дорожках при ДГГЭ. Работа с полученными из них гетеродуплексами позволяет значительно повысить разрешающую способность метода и долю обнаруживаемых мутаций. Причина заключена в том, что неспаренные участки гетеродуплекса, в которых имеются однонуклеотидные замены, сильно снижают стзкинг-взаимодействия оснований, дестабилизируя вторичную структуру, а это, в свою очередь, приводит к снижению температуры плавления фрагмента ДНК- В ряде случаев замена всего одного нуклеотида обусловливала снижение температуры на целых 6°С. Анализ большого числа гетеродуплексов и теоретические подсчеты показывают, что все возможные замены нуклеотидов в легкоплавких доменах, приводящие к образованию неспаренных участков во фрагменте ДНК, выявляются при помощи ДГГЭ с вероятностью 100% за счет изменения подвижности. На долю легкоплавких областей во фрагментах ДНК от 100 до 1000 п.н. приходится в среднем более 50% их длины, следовательно, использование гетеродуплексов таких фрагментов позволяет выявить более половины всех возможных замен нуклеотидов. В клонированных же фрагментах ДНК с «GC-зажимом» выявляются практически все замены нуклеотидов.

Гетеродуплексы дают возможность наблюдать изменение подвижности мутантных фрагментов ДНК в геле, не выявляемое при стандартных условиях проведения электрофореза. Зачастую единичные мутации можно обнаружить по вызываемым ими значительным изменениям структуры доменов во фрагменте ДНК-Изменения эти отражаются и на характере плавления ДНК: домены, имевшие изначально самую высокую температуру плавления, могут стать самыми легкоплавкими. Таким образом, когда вместо гомодуплексов используются гетеродуплексы, ДГГЭ позволяет выявлять замены нуклеотидов даже в самых тугоплавких доменах.

1.2.2 Практическое использование ДГГЭ

Приведенные здесь схемы ДГГЭ обеспечивают более высокую разрешающую способность и эффективность обнаружения мутаций за счет использования гетеродуплексов. Их основные этапы приведены на рис. 4. Исследуемые препараты ДНК отжигают с меченым одноцепочечным ДНК-зондом, и если в них произошла замена нуклеотида, образовавшийся гетеродуплекс будет иметь однонуклеотидный неспаренный участок. Далее проводят электрофорез в денатурирующем геле с последующей радиоавтографией, используя в качестве контроля гомодуплекс ДНК дикого типа. Таким образом, в этом случае не требуется стадии блотинга геля. Кроме одноцепочечных ДНК-зондов можно использовать асимметрично меченные двухцепочечные ДНК-зонды, а также меченые одноцепочечные РНК-зонды для тестирования ДНК в гибридах РНК-ДНК или РНК в РНК-РНК-гибридах.

С помощью ДГГЭ, также как и при РНКазном расщеплении, можно исследовать фрагменты нуклеиновых кислот длиной от 100 до 1000 п.н. Верхний предел значений длин в некоторой степени определяется необходимостью использовать полиакриламидный гель. Подвижность в нем фрагментов ДНК длиной более 1000 п. н. резко снижается, а это значительно увеличивает время, необходимое для их электрофоретического разделения. Еще более серьезную проблему представляет собой характер плавления длинных фрагментов. Известно, что чем длиннее фрагмент, тем. больше в нем доменов плавления. При прохождении такого фрагмента через гель очень быстро наступает резкое снижение его подвижности, обусловленное плавлением одновременно большого числа доменов, что делает доступной для обнаружения замены лишь незначительную часть длинного фрагмента. В силу вышеуказанных причин мы стараемся работать с фрагментами, длина которых не превышает 1000 п. и. Поскольку для большинства фрагментов ДНК более половины их длины приходится на легкоплавкие домены, то денатурирующий электрофорез фрагмента в 1000 п. и. позволяет тестировать на нуклеотидные замены примерно 500 нуклеотидов. Для повышения информативности анализа можно использовать ДНК-зонд длиной 1000-2000 п.н.; отжигать его с геномной ДНК, обрабатывать соответствующими рестриктазами и получать при этом два-три фрагмента оптимального размера.

Таблица 1. Сравнительная характеристика методов градиентного анализа ПДРФ, рестриктазного расщепления и денатурирующего гель-электрофореза

1.3. Полимеразная цепная реакция

РНКазное расщепление и ДГГЭ можно использовать для непосредственного исследования фрагментов геномной ДНК, минуя стадию клонирования. Работая с равномерно меченными зондами, обладающими высокой удельной активностью, можно любым из этих методов получить желаемый результат, имея изначально 5-10 мкг геномной ДНК человека и проводя радиоавтографию 24 ч. Чем проще организм, тем выше чувствительность методов. Хотя получаемые результаты в большинстве своем можно оценить высоко, непосредственное использование суммарной геномной ДНК ставит перед исследователем ряд проблем. Это, во-первых, нередко низкое отношение сигнала к фону, особенно при РНКазном расщеплении. Во-вторых, активность равномерно меченных фосфором зондов должна быть настолько высокой, чтобы использовать их в течение дня или двух. В-третьих, при проведении некоторых анализов, особенно в случае множественных тестов, лимитирующим фактором может стать количество геномной ДНК. Любой тест тем предпочтительнее, чем меньшее количество ДНК требует.

В 1985 г. был описан принципиально новый метод, позволяющий в миллион раз амплифицировать интересующие последовательности в препарате геномной ДНК, - полимеразная цепная реакция, ПЦР. Идея метода и ее воплощение очень просты. Сначала синтезируются два дезоксиолигонуклеотида длиной 20-30 оснований, представляющие собой концевые последовательности интересующего фрагмента ДНК. Полярность выбрана так, чтобы после отжига их направления 5'-3' были обращены друг к другу. Избыточные количества этих олигонуклеотидов смешивают с геномной ДНК, и смесь нагревают для денатурации последней. Снижение температуры приводит к реассоциации олигонуклеотидов с гомологичными участками геномной ДНК. Затем проводят наращивание цепи при участии ДНК-полимер азы и дезоксирибонуклеотидтрифосфатов. Такая последовательность реакций денатурации, реассоциации и наращивания цепи повторяется 20-30 раз. Уже после двух циклов среди продуктов реакции появляются фрагменты ДНК, точно совпадающие по длине с исходным фрагментом, ограниченным олигонуклеотидами. Эти фрагменты служат матрицей для последующих реакций и идентичны большинству конечных продуктов. Процесс является по существу цепным, так как продукты данной реакции служат матрицей для последующих реакций. Количество вновь образующейся ДНК возрастает в геометрической прогрессии, поэтому за 20 циклов при 100% - ной эффективности каждого из них можно получить 220 молекул. На практике эффективность каждого цикла амплификации составляет 20-50%, т.е. при проведении достаточного числа циклов можно добиться увеличения количества специфической последовательности кратного миллиону.

Страницы: 1, 2