Основные подходы к первичной обработке биологического сырья. Сепарация, осаждение, экстракция
5
Основные подходы к первичной обработке биологического сырья. Методы гомогенизацииСхемы выделения целевого продукта в биотехнологическом производстве существенно различаются в зависимости от того, накапливается продукт в клетке или он выделяется в культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса (общая схема выделения на рис 1). Наиболее сложно выделение продукта, накапливающегося в клетках. Для этого клетки необходимо отделить от культуральной жидкости, разрушить (дезинтегрировать) и далее целевой продукт очистить от массы компонентов разрушенных клеток. Выделение продукта облегчается, если он высвобождается (экскретируется) продуцентом в культуральную жидкость. Предварительная обработкасепарациядезинтеграция экстракция экстракция, хроматограция, центрифугированиехроматограция, центрифугирование, электрофорезРисунок 1. Общая схема выделения БАС на заключительной стадии биотехнологического производства. Одним из первых этапов на пути к очистке целевого продукта является разделение культуральной жидкости и биомассы - сепарация. Иногда сепарации предшествует специальная обработка культуры - изменение рН, нагревание, добавление коагулянтов белков. Существуют различные методы сепарации (флотация, центрафугирование, фильтрование), которые будут подробно рассмотрены в соответствующих разделах. В данном разделе остановимся на методах гомогенизации (дезинтеграции) клеток или других образцов животного и растительного происхождения. 1. Методы гомогенизацииФизические методы. 1. Растирание с твердыми материалами. Метод состоит в растирании клеток с песком или абразивным порошком в ступке при помощи пестика. Хорошие результаты дает продавливание клеток, смешанных с абразивными частицами, через пресс Хьюза. Модификацией этого метода является продавливание клеток при темепературе -25. 2. Разрушение клеток в жидких средах. В этом случае разрушение происходит либо при вращении лопастей или поршня (блендеры), либо при поступательном движении вверх и вниз поршня или шаров (гомогенизаторы). 3. Разрушение клеток с помощью высокого давления. Применяется в основном для разрушения микробных клеток. Для этой цели пользуются специальными прессами, например френч-прессом. Разрушение клеток происходит, когда клеточную суспензию под давлением продавливают через узкое отверстие. 4. Разрушение с помощью ультразвука. 5. Замораживание - оттаивание. 6. Декомпрессия. Клеточную суспензию сжимают, а затем резко сбрасывают давление. Химические методы. 1. Добавление органических растворителей. Толуол, хлороформ, бензол2. Осмотический шок. Химико -ферментативные методы. Добавление антибиотиков, переваривание клеточных стенок ферментами или сложными ферментативными препаратами, выделенными из улиток. Далее перейдем к стадии получения целевого продукта. Здесь следует упомянуть три процесса, которые зачастую являются необходимыми при получении целевого БАС: консервация, стабилизация продукта, модификация продукта. 2. Консервация. Обезвоживание: Воздушная сушка при повышенной и нормальной температуре. Сушка в кипящем слое. Лиофилизация. Замена воды на неводные растворители (Глицерин, хранение штаммов микроорганизмов на твердых подложках). Замораживание, Добавка антибиотиков, Изменение рН, Изменение ионной силы3. Стабилизация продукта. Мероприятия, направленные на сохранение свойств продукта в период его хранения и использования потребителем. Обезвоживание и сушка. Добавление органических растворителей. Добавление неорганических ионов Со, Mg, Na (для пектиназы) Формалин (0,2% р-р для глюкоамилазы) Антибиотиков (низин для глюкоамилазы) Использование биотехнологического процесса для стабилизации. Меланж, получаемый из яичных желтков, - ценный пищевой продукт. Порча меланжа может быть предотвращена, если из него удалить углеводы. С этой целью на меланже рекомендуется выращивать пропионовые бактерии, «ведающие» углеводы. Срок хранения увеличивается кроме того, пропионовые бактерии повышают питательную ценность меланжа, обогащая его органическими кислотами и витамином В12. 4. Модификация продукта. Модификация необходима, когда получаем лишь «заготовку» целевого продукта. Пенициллин G, образуемый Penicillin potatum, модифицируют с целью получения ампициллина и других полусинтетических пенициллинов. Придание продукту соответствующей оптической ассиметрии, когда биообъект (скажем дрожжи) избирательно потребляет один из изомеров (например, L-аминокислоты), и в среде остается его оптический антипод. Получение ряда ферментов, гормонов, когда, например, у бычьего инсулина «отстригают» аминокислотные остатки, после чего он становиться идентичным человеческому гормону. Литература: 1. Б. Уильямс, К. Уилсон /Методы практической биохимии / Мир, 1975. 2. Н.С. Егоров, А.В. Олескин, В.Д. Самуилов /Биотехнология. Проблемы и перспективы/ книга 1, Высшая школа, 1987. 3. Ю.И. Детнерский /ПАХТ/, Т.2, стр272-274Сепарация, осаждение, экстракция1. Флотация. Если клетки продуцента в биореакторе из-за низкой смачиваемости накапливаются в поверхностных слоях жидкости. Флотаторы различных конструкций сцеживают, откачивают или соскребают пену, состоящую из пузырьков газа с прилипшими к ним клетками. Повышение эфективности отбора биомассы в виде концентрированной суспензии достигается вспениванием жидкости с последующим отделением ее верхнего слоя. Флотацию широко используют как первый этап отделения дрожжевой массы для осветления культуральной жидкости. 2. Мембранные процессы. Мембрану можно рассматривать как селективно-проницаемый барьер между двумя гомогенными фазами. Перенос через мембрану имеет место при наложении движущей силы, действующей на компоненты. В большинстве мембранных процессов движущей силой является разность давлений или концентраций (активностей) по обе стороны мембраны. Такие параметры, как давление, концентрация (активность) или даже температура, можно объединить в одном параметре - химическом потенциале ?. При постоянной температуре химический потенциал i-го компонента в смеси задается как mi=--mi_--+--RT--lnai + ViP где --mi_???? химический потенциал 1 моля чистого вещества при давлении ?Р ?и температуре Т. Для чистых веществ активность равна единице, но для жидких смесей активность определяется выражением: ai = Хi giгде Хi - мольная доля и gi i -коэффициент активности. Мембранные процессы можно классифицировать в соответствии с движущими силами процесса. Таблица 1. Движущая сила в различных мембранных процессах.Перепад давления | Градиент концентрации (активности) | Градиент температуры | Градиент электрического потенциала | |
Микрофильтрация Ультрафильтрация Обратный осмос Пьезодиализ | Первапорация Газоразделение Диализ Жидкие мембраны | Термоосмос Мембранная дистилляция | Электродиализ Электроосмос |
Мембранные материалы:
Гидрофобные полимерные мембраны: политетрафторэтилен (тефлон), поливинилденфторид, полипропилен.
Гидрофильные полимерные мембраны: эфиры целлюлозы, поликарбонаты, полисульфон, полиимид, алифатический полиамид.
Керамические мембраны: оксид алюминия, оксид циркония
Таблица 2. Основные параметры мембранных процессов и применение.
Назва-ние про-цесса | Мембра-ны | Толщи-на (мкм) | Размер пор | Мембра-нные метариа-лы | Движущая сила процесса | Принцип разделения | Применение | |
Микро-фильт- рация | Асиммет-ричные или симмет-ричные, пористые | 10 - 150 | 0,05 - 10 мкм | Полимерные и керамические | Давление (<2 бар) | Ситовой механизм | В аналитических целях, стерилизация (пища, лекарственные препараты), ультрачистая вода для полупроводников, осветление напитков, концентрирование клеток и мембранные биореакторы (биотехнология), плазмофорез (медицина) | |
Ультрафильтрация | Пористые асимметричные | 150 | 1 - 100 нм | Гидрофильные полимерные и керамические | Давление (1 - 10 бар) | Ситовой механизм | Молочная промышленность (обработка молока, сыворотки, сыроделие), пищевая промышленность (извлечение крахмала, белков), металлургия (разделение эмульсий масла в воде, извлечение красителей), текстильная промышленность (извлечение индиго), фармацевтическая промышленность (извлечение ферментов, антибиотиков и жаропонижающих препаратов). | |
Обратный осмос | Асимметричные или композиционные | Подложка 150 мкм, верхний слой 1 мкм. | <2 нм | Триацетат целлюлозы, ароматические полиамиды, полиуретановые эфиры | Давление (15 - 20 бар) солоноватая вода; (40 - 80 бар) морская вода | Растворение - диффузия | Обессоливание солоноватых вод и морской воды, производство ультрачистой воды (электронная промышленность), концентрирование пищевых соков и сахара (пищевая промышленность), концентрирование молока (молочная промышленность) | |
Пьезодиализ | Мозаичные мембраны с чередованием катионных и анионообменных областей | Несколько сот мкм | непористые | Катионо-анионообмен-ные смолы | Давление (до 100 бар) | Ионный транспорт | Концентрирование солей. | |
Газоразделение | Композиционные или асимметричные с верхним слоем из эластомера или стеклообразного полимера | Подложка 150 мкм, верхний слой 0,1 - 5 мкм. | Непористые или с порами <1 мкм | Эластомеры: полидиметилсилоксан, полиметилпентен. Стеклообраз-ные полиме-ры: полиимиды, поли-сульфон | Давление над мембраной до 100 бар, или вакуум после мембраны | Механизм растворение диффузи (непористые мембраны); Кнудсеновский поток (пористые мембраны) | Извлечение водорода или гелия, СН4/СО2, Н2S |