При производственной необходимости после определения типовой принадлежности вируса ящура устанавливают его подтип (вариант). Для этого ставят РСК по той же методике, но используют вариантные сыворотки и вариантные антигены установленного типа. Причем вариантные сыворотки используют в предельном титре, а антигены в удвоенном. Антиген (исследуемый) относят к тому варианту, с сывороткой которого он дает положительную реакцию в более высоких разв Едениях .
Заключение. Испытуемый штамм относится к варианту A22.
Когда доставленного из хозяйства вирусного материа недостаточно для исследования в РСК, проводят его расплодку на культуре клеток или на 3-6-дневных мышатах-сосунах, или на взрослых морских свинках. Мышатам исследуемую суспензию вводят подкожно в области спины в дозе 0,1--0,2 мл, морским свинкам -- внутрикожно в подушечки обеих задних конечностей в дозе 0,2--0,5 мл. За животными наблюдают 5--7 дней.
В случае гибели мышат из их тушек готовят антиген для РСК. У морских свинок в положительных случаях на лапках образуются афты; стенки афт и их содержимое используют в РСК. При необходимости проводят 2--3 "слепых" пассажа. Пробу исследуемого материала считают отрицательной, если в третьем пассаже не будет отмечено дегенерации клеток и падежа белых мышей, а при исследовании полученных из них суспензий в РСК не будет обнаружен антиген вируса ящура.
Ретроспективная диагностика.
Материалом для исследования на наличие антител к вирусу ящура служат сыворотки крови животных, подозреваемых в переболевании ящуром или другими везикулярными болезнями. Сыворотки крови должны быть взяты не ранее чем через 7 дней с момента появления у животных признаков везикулярного заболевания. На исследование следует направлять 5--10 проб сыворотки от животных каждой возрастной группы. При сомнительных результатах первичного исследования необходимо отобрать кровь повторно от тех же животных через 7-- 10 дней.
Сыворотку, полученную общепринятым методом, консервируют антибиотиками (по 500 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина) или замораживают при минус 20 °С. На исследование направляют от каждого животного не менее 5 мл сыворотки в термосе со льдом.
В лаборатории сыворотку исследуют с помощью реакции радиальной иммунодиффузии (РРИД) и реакции непрямой иммунофлуоресценции (НРИФ).
РРИД. Сущность реакции заключается в формировании зоны специфической преципитации вирусных антигенов антителами, включенными в состав агарового геля. РРИД типоспецифична.
Для постановки реакции расплавленный 2%-ный агар смешивают с равным объемом нагретой до 50--55 °С испытуемой сыворотки в разведениях 1 : 5, 1 : 10, 1 : 20 и т. д. до 1 : 320 и наносят по 4 мл на предметное стекло. В застывшем агаре вырезают лунки (диаметром 4--7,7 мм), которые заполняют эталонными типовыми антигенами. Затем стекла помещают во влажную камеру при температуре 37 °С. Результаты учитывают через 6--7 ч и окончательно через 18 ч.
Положительная реакция характеризуется образованием кольца преципитации в виде опалесцирующей зоны вокруг лунки с антигеном, гомологичным возбудителю, вызвавшему заболевание .
Антитела, обнаруженные в испытуемой пробе сыворотки, относят к тому серотипу, с антигеном которого они дали положительную реакцию. Их титром считают максимальное разведение испытуемой сыворотки, с которым наблюдается положительная реакция.
После переболевания животных титры антител обычно превышают 1 : 160.
НРИФ. Данная реакция основана на том, что наличие антител в сыворотке крови переболевших животных выявляет специфическое свечение (комплекса антиген + антитело), а при использовании сывороток от вакцинированных животных свечение комплекса не наблюдается.
Техника постановки заключается в следующем. На препарат из культуры клеток ВНК-21, ПЭК, ПЭС, инфицированных вирусом ящура любого типа, наносят испытуемую сыворотку в разведении 1: 10 и 1 :20; инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин; отмывают несвязавшиеся антитела; подсушивают на воздухе и окрашивают смесью рабочих разведений флуоресцирующей антивидовой сыворотки и бычьего альбумина, меченного родамином; Инкубируют во влажной камере при 37 °С 30 мин; отмывают; подсушивают и просматривают под люминесцентным микроскопом (объектив х40, окуляр х4 или х5). Положительная реакция характеризуется зеленым или из рудно-зеленым свечением цитоплазмы клеток.
Диагностический результат считают положительным при обнаружении специфического свечения хотя бы в одной из 5--10 сывороток, присланных из данного хозяйства.
Для определения уровня обнаруженных таким образом антител в испытуемой сыворотке проводят ее титрование. Для этого испытуемую сыворотку разводят от 1 : 40 до 1 : 1280, и каждым разведением обрабатывают заведомо инфицированный препарат, как было указано выше. О титре постинфекционных антител в сыворотке судят по предельному ее разведению, которое способно давать положительную НРИФ. Наличие специфического свечения в препаратах, обработанных испытуемой сывороткой в разведениях 1 : 10, 1 : 20 и 1 : 40, свидетельствует о том, что сыворотка была получена в период острого переболевания животного ящуром, т. е. с момента его заболевания прошло около 7 дней, а наличие специфического свечения в разведениях 1 : 80 и выше -- о том, что сыворотка взята от животного-реконвалесцента.
Результаты исследования на ящур оформляют в виде протокола, в котором указывают дату исследования, наименование хозяйства, материала, краткие эпизоотологические данные и т. д. и обязательно наименование компонентов, используемых в исследовании, характеристику контролей.
Необходимо отметить, что для индикации и типирования вируса ящура разработано много других методов, таких, как ПЦР, РНГА, ИФА, метод перекрестного иммунитета и др.; для обнаружения и типирования антител -- РН, РНГА, реакция серозащиты на мышатах-сосунах и др.
Дифференциальная диагностика. Необходимо исключить другие заболевания животных с везикулярным синдромом, такие, как ВД, ИРТ, везикулярный стоматит, у свиней -- везикулярную болезнь, везикулярную экзантему, у овец -- катаральную лихорадку.
Иммунитет и специфическая профилактика.
Продолжительность иммунитета у животных, переболевших ящуром, составляет 8--12 мес, у свиней -- 10--12, у овец -- 18 мес. При очень напряженном иммунитете может наблюдаться некоторая устойчивость к заражению гетерологичным типом вируса. При ящуре возникает тканевой и гуморальный иммунитеты. Основное значение в защите животных от заболевания принадлежит гуморальным факторам иммунитета. Для специфической профилактики ящура применяют инактивированные вакцины. В нашей стране нашли широкое применение следующие 3 вакцины: лапинизированная гидро-окисьалюминиевая сапонинформолвакцина, которую готовят из вируса, репродуцированного в организме новорожденных крольчат; гидроокисьалюминиевая сапонинформолвакцина из вируса, культивируемого в ткани слизистой оболочки языка.
Для свиней используют противоящурную эмульгированную вакцину из лапинизированного вируса.
Иммунитет после вакцинации у взрослых животных длится 4-- 6 мес. После ревакцинации иммунитет более напряженный и продолжительный.
Молодняк, родившийся от иммунных животных, получает пассивно антитела с молозивом. Антитела у телят сохраняются в течение 5 мес, хотя пассивная защита продолжается до 3--4 мес.
Инактивированные вакцины могут быть моно- или поливалентными, т. е. содержать антигены одного или многих типов и вариантов вируса. Живые вакцины против ящура не разработаны. Проводятся исследования по разработке и использованию синтетических вакцин, а также молекулярных вакцин, полученных с помощью методов генной инженерии.
4. Культивирование вирусов в культуре клеток
Культуры клеток и тканей - это кусочки органов и тканей, выращенных в питательной среде вне организма, сохраняют жизнеспособность, а некоторые размножаются.
Для культивирования необходимы:
- исходный материал (ткани эмбрионов, клетки почки, кожи, селезенки). Обязательо соблюдение правил асептики и антисептики;
- температура должна быть 36 -38 градусов Цельсия;
- питательная среда , которая должна обладать буферностью и изотоничностью, т.е. включать в себя Na, K, Ca, Mg, Cl, фосфаты, карбонаты;
- РН среды должна быть 7,2 - 7,4 единиц;
- все питательные элементы, особенно глюкоза, которая отвечает за энергетический обмен;
- аминокислоты;
- витамины, которые являются ко-ферментами.
Среды бывают двух видов:
1. натуральные или естественные ( кровь, амниотическая жидкость);
2. 2.синтетические и полусинтетические (из химических веществ, солевые растворы - раствор Эрла и раствор Хэнкса)
Методика сводится к следующему:
1. подбору культуры клеток;
2. получению вирус -содержащего материала;
3. подготовке для заражения;
4. заражению клеток вируссодержащим материалом;
5. культивированию вируса в клетках;
6. индикации вируса в культуре клеток;
7. сбору культуральной жидкости и идентификации в ней вируса.
Подбор культур клеток. Не всякая клетка чувствительна к любому вирусу. Вирус к первичной культуре обычно успешно адаптируется при условии, если культура получена из органов животного, естественно восприимчивого к данному вирусу. Однако адаптация вируса к перевиваемым клеткам более сложна, а в ряде случаев неосуществима. Для культивирования некоторых вирусов до сих пор неизвестно ни одной клеточной системы. Для культивирования вируса используют обычно молодые клетки, т. е. в первый день формирования монослоя, а в некоторых случаях (для парвовирусов свиней) клетки заражают при их посеве, так как вирус интенсивно размножается при наличии делящихся клеток (когда они находятся в стадии логарифмического роста).
Заражение клеток.
Для этого отбирают пробирки (или матрасы) со сплошным клеточным монослоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа. Ростовую питательную среду сливают, клетки 1--2 раза промывают раствором Хенкса, чтобы удалить сывороточные антитела и ингибиторы. В каждую пробирку вносят по 0,1--0,2 мл вируссодержащего материала и покачиванием распределяют его равномерно по слою клеток. В таком виде пробирки (матрасы) оставляют от 1 до 2 ч при 22 или 37 "С для адсорбции вируса на поверхности клеток. Затем вируссодержащий материал удаляют из пробирок (матрасов) и наливают поддерживающую среду (в пробирку 1--2 мл, в матрасы около 10% его объема). При выделении вируса из патологического материала некоторые пробы (фекалий и др.) могут оказывать токсическое действие на клетки, поэтому после адсорбции вируса монослой клеток отмывают 1--2 раза раствором Хенкса (или питательной средой) и затем наливают поддерживающую среду.
Культивирование вируса.
Пробирки (матрасы) закрывают герметически резиновыми пробками и ставят на инкубацию в термостат при 37 °С. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки -- под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе -- роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании.
Для каждой пробы материала обычно используют не менее 4--10 пробирок с культурой клеток. Для контроля оставляют 4--6 пробирок с незараженной культурой клеток, в которых заменяют ростовую среду на поддерживающую.
В культурах клеток, зараженных вирусом, питательную среду можно не менять в течение 7 дней, а рН среды (6,9--7,4) поддерживать с помощью 7,5%-ного раствора бикарбоната натрия. При более длительном культивировании инфицированных клеток (аденовирусы и др.) среду меняют.
Все пробирки (матрасы) после заражения клеток ежедневно исследуют под малым увеличением микроскопа, сравнивая культуры клеток, зараженные вирусом, с контрольными.
В термостате адсорбировавшиеся на клетках вирусные частицы проникают внутрь их и начинается их репродукция. Новые вирусные частицы покидают (полностью или частично) клетки, в которых они образовались, проникают в непораженные клетки, репродуцируются в них, переходят в новые клетки и поражают их. Так продолжается до тех пор, пока есть живые неповрежденные клетки. В результате этого процесса практически все клетки в матрасе или пробирке поражаются вирусом, хотя абсолютно все почти никогда не поражаются.
Вирус накапливается в основном в культуральной жидкости, но часть вирионов может оставаться и внутри не разрушенных вирусом клеток. Чтобы оставшийся в клетках вирус освободить, клетки тщательно разрушают или многократным замораживанием -- оттаиванием (2--3 раза), или с помощью ультразвука.
Индикация (обнаружение) вируса в культуре клеток.
Существуют следующие основные методы индикации вируса в культуре клеток: по цитопатическому эффекту, или цитопатическому действию (ЦПЭ,ЦПД); по положительной реакции гемадсорбции (РГАд); по образованию бляшек; по обнаружению внутриклеточных включений; по выявлению вирусов в реакции иммунофлуоресценции (РИФ); по обнаружению интерференции вирусов; по подавлению метаболизма клеток (цветная проба); электронной микроскопией и др.
ЦПД.
Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому эффекту, или цитопатическому действию. ЦПД называются любые изменения клеток под влиянием размножающегося в культуре клеток вируса. Физиологические изменения клеток установить довольно сложно, а морфологические изменения обнаруживаются довольно легко. Для этого достаточно положить на предметный столик микроскопа пробирку или матрас слоем клеток вверх и, используя малое увеличение (объектив х8--10, окуляр х7--10), осмотреть слой. Полезно сравнить клетки, зараженные вирусом, с такими же клетками в пробирке, не подвергавшимися заражению. В этом случае практически любые наблюдаемые в микроскоп отличия зараженной культуры клеток от контрольной можно считать проявлением ЦПД. Эти отличия могут захватывать весь монослой или отмечаться только в виде небольших очажков измененных клеток в слое нормальных клеток. Интенсивность ЦПД выражается тем, какая часть клеточного монослоя изменена вирусом. Хотя общепринятой системы оценки интенсивности ЦПД нет, ее часто оценивают в крестах или баллах. Так, если изменению (по сравнению с контролем) подвергся весь монослой в пробирке или матрасе, ЦПД оценивают на четыре креста, если 3/4 -- на 3 креста, если 1/2 - на 2 креста, 1/4 -- на один крест. Но эти оценки все же весьма условны.
Формы ЦПД зависят от биологических свойств вируса, вида клеток, дозы заражения, условий культивирования и т. д. Одни вирусы проявляют ЦПД через 2--3 сут после заражения (энтеровирусы), другие -- через 1--2 нед (аденовирусы).
Наиболее существенно различаются между собой три формы ЦПД: фрагментация клеток, округление клеток, симпластообразование (рис. 1,2)
Фрагментация -- разрушение клеток на отдельные фрагменты, которые отделяются от стекла и переходят в культуральную жидкость в виде клеточного детрита (вирус везикулярного стоматита).
Округление -- потеря клетками способности прикрепляться к стеклу, вследствие чего клетки, обычно распластанные по стеклу, принимают шаровидную форму, отделяются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости, где и погибают (энтеровирусы, аденовирусы и др.).
Симпластообразование -- растворение клеточных оболочек, вследствие чего цитоплазмы соседних клеток сливаются, образуя одно целое, в котором располагаются (главным образом по периферии) ядра клеток. Такие образования из цитоплазматической массы с многими клеточными ядрами называются симпластами (гигантские многоядерные клетки). Их образование объясняют двояко: нарушением процесса деления клеток под влиянием вируса или тем, что некоторые вирусы содержат фермент (лецитиназу), который растворяет клеточные оболочки, в результате цитоплазмы расположенных рядом клеток сливаются. ЦПД в культуре клеток способно вызывать большинство вирусов, поэтому этот метод индикации вирусов в культуре клеток применяют очень широко. Однако есть вирусы, которые, размножаясь в культуре клеток, ЦПД не вызывают (вирусы бешенства, классической чумы свиней, некоторые штаммы вируса диареи крупного рогатого скота и др.). Клетки остаются жизнеспособными, но интенсивность клеточного деления понижается, со временем изменяется и их морфология.
При неопластической трансформации пораженных клеток в монослое образуются плотные фокусы трансформации различной величины и формы, белого цвета (вирус саркомы Рауса).
Отсутствие ЦПД в первом пассаже еще не говорит об отсутствии вируса, который не всегда размножается настолько быстро, чтобы вызвать ярко выраженное ЦПД. Поэтому и прибегают к "слепым" пассажам. Необходимо провести не менее трех "слепых" пассажей, прежде чем судить о наличии вируса в исследуемом материале.
РГАд. Гемадсорбция -- соединение эритроцитов с поверхностью пораженных вирусом клеток -- впервые была обнаружена Фогелем и Щелоковым (1957) на культуре ткани, инфицированной вирусом гриппа. В последующем выяснилось, что этой способностью обладает ряд других вирусов: парагриппозные, оспо-вакцины и оспы, ньюкаслской болезни, гриппа млекопитающих и птиц. Наиболее ценным оказалось применение этой реакции для выявления и идентификации парагриппозных вирусов животных (ПГ-3 крупного рогатого скота, парагриппа овец, вируса Сендай). В основе этого явления лежит родство рецепторов вируса, находящихся на поверхности пораженной клетки, с рецепторами эритроцита, что приводит к их взаимному сцеплению аналогично реакции гемагглютинации. Преимущество этой реакции состоит в том, что она становится положительной еще до появления отчетливых цитопатических изменений в инфицированных клетках. Для постановки реакции используют эритроциты морской свинки, обезьян, человека (группы О) и другие эритроциты, чувствительные к гемагглютинирующему действию изучаемого вируса.
Методика РГАд
Состоит в следующем. На 3--4-й день после инфицирования клеток берут две пробирки с одинаковой культурой клеток, из которых одна заражена вируссодержащим материалом, а вторая контрольная. Из обеих пробирок сливают культуральную жидкость и вносят в обе по 2--3 капли 0,5%-ной суспензии отмытых эритроцитов. Обе пробирки оставляют на 5--10 мин так, чтобы эритроциты были на поверхности клеток (кладут горизонтально на стол), а затем слегка споласкивают физраствором и исследуют под микроскопом (малое увеличение). В контрольной пробирке эритроциты полностью удаляются с физраствором, а некоторые из оставшихся плывут вместе с жидкостью. Если в зараженной пробирке эритроциты не удалились с физраствором и не плывут, а прикреплены к поверхности клеток, следует считать РГАд положительной
В зависимости от вируса и вида клеток расположение эритроцитов может быть трояким:
-эритроциты адсорбированы только по периферии клеточного пласта в виде "ожерелья" (вирус африканской чумы свиней);
-эритроциты расположены на слое клеток очагами или скоплениями (вирус гриппа);
-эритроциты расположены на слое клеток диффузно (вирус парагриппа).
Каждый вирус способен адсорбировать эритроциты крови животных определенных видов. Если вирус на данной культуре клеток вызывает и ЦПД, и РГАд, то гемадсорбция проявляется раньше, чем ЦПД. Метод этот пригоден для индикации в культурах клеток только некоторых вирусов и поэтому применяется нечасто. Однако для индикации ряда вирусов (вирусы африканской чумы свиней, парагриппа-3 крупного рогатого скота и др.) он незаменим При отсутствии гемадсорбции на 3--4-й день после инфицирования через каждые 2--3 дня берут следующие пробирки с инфицированной культурой клеток и ставят РГАд по описанной выше методике. Пробирки с культурой клеток находятся под наблюдением в течение 14--20 дней. При отрицательной реакции гемадсорбции в первом пассаже проводят следующий пассаж и РГАд.
РГАд используют для обнаружения вируса в культуре клеток, для титрования его и при постановке реакции нейтрализации с целью определения титра антител в сыворотках крови животных.
Метод образования бляшек.
Этот метод обнаружения вирусов технически сложнее других и применяется главным образом для титрования вирусов.
Дальбекко и Фогт в 1954 г. впервые предложили методику получения бляшек под агаром в культуре куриных фибробластов с вирусом западного лошадиного энцефаломиелита. В последующие годы многие авторы с успехом применяли этот метод при изучении различных вирусов -- ящура, везикулярного стоматита, ньюкаслской болезни, чумы птиц, полиомиелита, Коксаки и др. Метод бляшек стали широко применять в вирусологии для получения чистых популяций вируса, особенно при изучении их генетических свойств. Методику получения бляшек, предложенную Дальбекко и Фогтом, модифицировали, и в настоящее время есть целый ряд отличных друг от друга методов, связанных с изучением различных вирусов.
Метод бляшек основан на образовании вирусом в однослойных культурах, залитых агаровой средой, содержащей витальный краситель -- нейтральрот, негативных колоний или бляшек. Бляшки представляют собой обесцвеченные участки культуры, состоящие из погибших под действием вируса клеток. Кроме агара в целях предотвращения переноса вируса на другие места можно использовать крахмал и метилцеллюлозу. Некоторые вирусы дают бляшки без покрытия слоем агара, например вирус чумы крупного рогатого скота, осповакцины, некоторые представители вирусов герпеса и др.
При постановке бляшек особое внимание должно быть обращено на качество культуры, она должна иметь сплошной рост клеток без признаков дегенерации. Лучше всего использовать культуры, выращенные во флаконах или матрасах различного типа. На клетки, промытые средой или раствором Хенкса, наносят вирус в определенных разведениях и обеспечивают контакт вируса с клетками при периодическом покачивании в точно установленный отрезок времени (1-2ч) при 37 -38 градусах Цельсия. Неадсорбировавшийся вирус удаляют путем промывания раствором Хэнкса или отсасывают пастеровской пипеткой, затем на слой клеток наносят специальное агаровое покрытие. Выбор среды покрытия определяется видом клеток и вируса.
Обычные компоненты агарового покрытия -- агар, раствор Эрла, телячья сыворотка, нейтральный красный, раствор соды (NaHC03), среда, антибиотики.
После застывания (30--60 мин) с поверхности агара сливают конденсированную влагу, флаконы переносят в термостат и инкубируют клетками вверх. Время инкубации и температура должны быть оптимальными для бляшкообразования, вызываемого данным вирусом. Наблюдение за появлением бляшек проводят в течение нескольких дней. За это время вирусы, адсорбировавшиеся на клетках, проникают в последние, проходят цикл репродукции, выходят из клеток и поражают соседние клетки. В сплошном слое живых клеток возникают островки мертвых, погибших вследствие репродукции в них вируса клеток. Раствор красителя окрашивает только живые клетки. Поэтому в матрасе на ровном красновато-розовом фоне появляются бесцветные пятна, которые и называются негативными пятнами Дальбекко или бляшками. Каждая бляшка соответствует островку мертвых клеток. Бляшки в культуре клеток образуют многие вирусы. При большой плотности (соответствующей низким разведениям вируса) они часто сливаются друг с другом. Время появления и морфология бляшек зависят от вида и штамма вируса, типа клеток и условий культивирования.
В основу титрования вирусов положены наблюдения Дальбекко и Фогта, показавших линейную зависимость между дозой внесенного вируса и количеством образующихся бляшек. Они показали, что для образования одной бляшки достаточно одной инфекционной вирусной частицы. Однако это положение верно при определенных условиях, и, прежде всего, при внесении в культуру больших разведений вирусов, исключающих возможность множественного заражения клеток.
Цветная проба.
Цветную пробу для лабораторных исследований впервые предложили Солк, Янгнер и Уорд в 1954 г. Предпосылкой для разработки данного метода явились наблюдения Эндерса, Уэллера и Роббинса, которые отметили, что в незаражен-ных тканевых культурах под влиянием продуктов метаболизма рН среды сдвигается вкислую сторону, что улавливается попожелтению фенолрота, добавленного в питательную среду. В то же время жидкость в тканевых культурах, зараженных вирусом, убивающим живые клетки, сохраняла свой красный цвет. Наиболее отчетливые результаты дают вирусы с высокой скоростью размножения при культивировании их на медленнорастущих клетках. Это способ не не отличается высокой достоверностью..
Обнаружение внутриклеточных включений.
При многих вирусных заболеваниях в клетках (в цитоплазме или ядре) различных органов и тканей появляются особые образования, называемые тельцами-включениями. Их классифицируют по локализации в клетке, составу нуклеиновой кислоты, тинкториальным свойствам и гомогенности.
Тельца-включения локализуются избирательно: при оспе, гриппе, бешенстве, парагриппе и других болезнях, как правило, развиваются цитоплазматические включения; при ринотрахеите крупного рогатого скота, ларинготрахеите птиц, аденовирусной инфекции и других -- ядерные.
Для приготовления препаратов культур клеток с целью выявления телец-включений клетки выращивают на покровных стеклах в пробирках или пенициллиновых флаконах, заражают испытуемым материалом и через определенные сроки инкубации при 37 °С (что зависит от свойств инокулированного вируса) стекла вынимают, промывают в теплом растворе Хенкса или физиологическом растворе (рН 7,0--7,2), подсушивают фильтровальной бумагой и фиксируют в одной из фиксирующих смесей: растворе Буэна -- 10--15 мин, фиксаторе Карнуа -- 10, Ценкера--20--30, метиловом спирте --15 мин или в других фиксаторах. Затем препараты окрашивают.
Вирусные тельца-включения хорошо обнаруживаются в препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином. Для этого фиксированные на покровных стеклах клетки промывают в дистиллированной воде и погружают на 5--15 мин в раствор гематоксилина (гематоксилин Майера, Эрлиха, Карацци и др.). Время окрашивания подбирают эмпирически для каждой культуры клеток и краски. Затем препараты отмывают водой и помещают на 1--2 мин в аммиачную воду (на 200 мл дистиллированной воды добавляют 2--3 капли аммиака). В щелочной среде ядра клеток приобретают синий цвет. Далее препараты окрашивают 0,1%-ным водным раствором эозина 30--60 с, удаляют лишнюю влагу фильтровальной бумагой, проводят по спиртам возрастающей концентрации: 70, 80, 96 (первый раз), 96 (второй раз), 100° + ксилол (1 : 1), ксилол и заключают в бальзам. В каждом из спиртов и ксилоле препараты держат не более 1 мин. Перед перенесением препаратов в следующую бюксу обязательно снимают с него фильтровальной бумагой лишнюю влагу, иначе спирт будет обводняться. При окраске гематоксилин-эозином ядра клеток окрашиваются в синий цвет, цитоплазма -- в розовый, а тельца-включения -- в синий или розовый Для обнаружения телец-включений при гриппе довольно часто используют окраску культур клеток по методу Клисенко. Для этого стекла с зараженной культурой клеток споласкивают теплым (37 °С) физиологическим раствором и фиксируют в жидкости Дюбоска -- Бразила--Буэна от 20 мин до нескольких недель. Тщательно отмытые (3--4 раза) в дистиллированной воде объекты окрашивают 10 мин 1%-ным раствором акридинового оранжевого, тщательно отмывают дистиллированной водой, затем снова окрашивают 1%-ным раствором эозина 30 мин, промывают дистиллированной водой и допропитывают раствором (1 : 1000) метиленового синего. Последний готовят перед употреблением из 1%-ного маточного раствора.
Окрашенные препараты промывают дистиллированной водой, дифференцируют в подкисленном (2--3 капли ледяной уксусной кислоты на 50 мл спирта) абсолютном спирте до появления розово-синего оттенка. Обезвоживают абсолютным спиртом и, проводя через ксилол, заключают в бальзам. Цитоплазма окрашивается в нежно-розовый цвет, ядро -- в розово-сиреневый, ядрышки -- в синий, вирусные включения -- в ярко-красный .
Для окраски клеток крови, костного мозга или культур клеток из лимфоидных органов обычно применяют окраску по методу Романовского--Гимзы.
Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции.
В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.
Метод, основанный на интерференции вирусов.
Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни -- вируса везикулярного стоматита и т. д.
Получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожномышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.
Куриные эмбрионы 9--11-дневной инкубации овоскопируют. Отбирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша.
Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2--3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эмбрион в стерильную чашку Петри. У эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожномышечный мешок переносят в стерильную майонезную банку (250 мл) и измельчают ножницами на кусочки 3--4 мм.
Измельченную ткань 2--3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35--37 °С (соотношение ткани и трипсина 1 : 3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку
Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3--5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3--5) до полного истощения ткани.
После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин-1 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питательной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр.
После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток.
Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации. Клетки подсчитывают в камере Горяева.
К 1 мл взвеси клеток добавляют равный объем 0,1%-ного раствора кристаллвиолета, приготовленного на 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания камеру заполняют взвесью клеток и подсчитывают все клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму; группу клеток с явными контурами считают за одну клетку.
На основании подсчета клеток в двух камерах высчитывают среднее арифметическое в одной из них. Число клеток в 1 мл суспензии (X) определяют по формуле
Х**(А:2- 1000): 0,9,
где А -- среднее число клеток в одной камере; 2 -- коэффициент разведения суспензии краской; 1000 -- число мм3 в 1 см3; 0,9 -- объем камеры Горясва, мм3.
После подсчета суспензию клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 700 тыс. до 1 млн клеток (для куриных фибробластов).
Пример. В 1 мл полученной суспензии клеток (100 мл) содержится 4 млн клеток. Следовательно, всего в 100 мл суспензии 400 млн клеток. Посевная концентрация -- 1 млн клеток в 1 мл. Исходную суспензию клеток (100 мл) доводят ростовой питательной средой до 400 мл.
Затем суспензию разливают в матрасы или пробирки. В пробирки заливают по 1 мл, в матрасы вместимостью 1000, 250 и 100 мл вносят соответственно 100, 40 и 15 мл взвеси клеток. Сосуды и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками (для предупреждения защелачивания среды), делают надпись (вид культуры клеток и дату). На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх в лотки с наклонным углом 5° и помещают в термостат при 37 °С.
Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, это свидетельствует о плохой обработке посуды или токсичности сыворотки, питательной среды. Пролиферирующие клетки светлые, связаны цитоплазматическими отростками, растут однослойным пластом. В процессе размножения клеток выделяются продукты обмена веществ, которые вызывают изменение рН питательной среды в кислую сторону (среда желтеет), что отрицательно влияет на клетки и может привести их к гибели. Такую среду заменяют свежей. Обычно сплошной монослой куриные фибробласты образуют через 36--48 ч.
От одного куриного эмбриона получают 70--120 млн клеток. Культуры клеток куриных фибробластов используют при работе с вирусом болезни Ауески, оспы птиц, ньюкаслской болезни, гриппа птиц, вируса саркомы Рауса и др.
Список литературы
1. Р.В. Белоусова, Э.А Преображенский, И.В. Третьякова "Ветеринарная вирусология" - М.: КолосС, 2007г.
2. В.Н.Сюрин, Р.В.Белоусова, И.В.Фомина "Ветеринарная вирусология" - М.: ВО " Агропромиздат", 1991г.
3. Р.В.Белоусова, Н.И.Троценко,Э.А.Преображенская "Практикум по ветеринарной вирусологии" - М.: КолосС, 2006г.
