Милбемицины были открыты в 70-х годах в Японии в результате широкого направленного поиска инсектицидов микробного происхождения. Их продуцентом является Streptomyces nigroscopicus, образующий смесь биологически активных веществ. Милбемицины, как и авермектины, не проявляют антибактериальной активности, но обладают широким спектром нематицидного действия, а также проявляют инсектицидные и акарицидные свойства в отношении широкого круга вредителей с/х культур и гельминтов крупного рогатого скота.
Среди инсектицидных метаболитов актиномицетов обнаружены вещества, как общетоксического действия (авермектины, милбемицины, празиноны и др.), так и специфические регуляторы роста и развития насекомых, в частности, ингибиторы синтеза хитина - никкомикомицины.
Широким спектром инсектоакарицидного действия обладает пиерицидин и его производные. Наиболее изучены биологические свойства пиерицидинов А и В. Эти препараты высокоэффективны в отношении комнатной мухи, рыжего таракана, стеблевого бурильщика, шелковичного червя, репной белянки, персиковой тли, бобовой и гороховой тлей (Самоукина Г.В., Кандыбин Н.В., 1981, том 51; Самоукина Г.В., 1983, том 53).
В институте с/х микробиологии г. Санкт-Петербурга создан препарат Актинин (Самоукина Г.В., Кандыбин Н.В., Сергеева М.В., Бортник Н.И., 1990).
Актинин - актиномицетный препарат, создан на основе актиномицета Streptomyces globisporus штамма 0234 при глубинном культивировании (ВНИИ с/х микробиологии). Препаративная форма - жидкость, порошок, концентрат - Л, концентрат - М. Действующее вещество - эндометаболиты нонактиновой группы. Жидкая форма - культуральная жидкость, или ее высушивают, и порошок применяют в виде водной суспензии. Актинин-Л и Актинин-М получают концентрированием культуральной жидкости, экстрагированием и фильтрацией.
Препарат эффективен (на уровне 85-100%) против паутинного клеща на овощных культурах защищенного грунта при норме расхода Актинина-Л - 100-200 л/га, расход рабочего раствора 1000-3000 л/га; против колорадского жука на картофеле при норме расхода 4 кг/га, расход рабочего раствора 150-400 л/га (Новикова И.И., Бойкова И.И., Павлюшин В.А., Матевосян Г.Л., Паршин В.Г., № 33, 2002; Павлюшин В.А., Агасонова Н.Е., 2001). В список пестицидов, разрешенных для применения, препарат не внесен.
В последние годы появились сообщения об использовании антрациклиновых антибиотиков и их производных для защиты растений. Большой резерв для открытия новых эффективных биопрепаратов кроется не только в выделении новых продуцентов, но и в более полном изучении их биологического потенциала.
Для успешного применения метаболитных препаратов в защите растений необходимо расширять поиск новых БАВ природного происхождения с различными механизмами действия, а, следовательно, необходимо совершенствовать стратегию скрининга микроорганизмов-продуцентов, использования достаточно широкий набор тестов.
Таким образом, по ряду показателей, а именно: отсутствию фитотоксичности, возможности совместного использования с энтомофагами; низкой токсичности и быстрому распаду в аэробных условиях; высокой специфичности и эффективности в отношении целевых вредоносных объектов в широком интервале гидротермических условий; биопрепараты на основе актиномицетов весьма перспективны для современных фитосанитарных технологий и, в частности, для комплексных систем защиты растений.
2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы и методы
2.1.1 Место проведения опытов и материалы
Исходным материалом для исследования в лабораторных условиях послужили пятнистая оранжерейная тля (Neomyzus circumflexus Buckt.) и лабораторная Санкт-Петербургская популяция хищной галлицы Aphidoletes aphidimyza Rond. (Diptera, Cecidomyiidae). Для выкармливания личинок галлицы использовали виковую тлю. Для обработок использовали: препараты на основе актиномицетов, выделенные из штаммов Streptomyces sp.
Характеристика препаратов
1. П-56 - на основе штамма Streptomyces loidensis, выделенного из почв Индии, является основой препарата Индоцид. В состав препарата входит комплекс метаболитов, обеспечивающий высокую инсектицидную активность против ряда вредных сосущих членистоногих: различных видов тли, трипса, паутинного клеща.
Показано, что компоненты комплекса, ответственные за инсектицидную активность, по химическому составу относятся к пептидолактонам треонинового типа. Работа по их идентификации продолжается.
Из П-56 выделен клон П-56-1, с отличным от исходного комплексом метаболитов, действие которого на насекомых еще изучается.
2. Streptomyces herbaricolor S-100 изолирован при микробиологическом обследовании дерново-подзолистых почв Западной Сибири вблизи г. Тюмени в 1989 году. Данные препараты находятся на стадии разработки.
Из S-100 был выделен клон с комплексом метаболитов, содержащий красный красящий пигмент. Поэтому далее мы называем его S-100кр.
Нами были проведены следующие эксперименты:
1) Оценка влияния микробиологических препаратов 729, 925, П-56, П-55, S-100 на выживаемость и развитие пятнистой оранжерейной тли;
2) Оценка влияния на выживаемость галлицы афидимизы при обработке препаратами П-56-1 и S-100кр. афидофага на эмбриональной, личиночной и на стадии кокона (сразу после окукливания и спустя некоторое время) инсектицидами микробиологического происхождения на основе штаммов Streptomyces sp. (далее препараты П-56, П-56-1, S-100, S-100кр.), которые были получены в результате скрининга коллекционных, а также свежевыделенных из почв изолятов, в лаборатории микробиологического метода защиты растений №8, ВИЗР.
2.1.2 Методы
Работа по оценке влияния преператов микробиологического происхождения на тлей и галлицу выполнялась в 2005 году в лаборатории биометода №7, ВИЗР под руководством с.н.с. Козловой Е.Г. совместно с лабораторией микробиологического метода защиты растений №8, ВИЗР.
2.1.3 Разведение виковой тли
Бобы выращивают в стеклянных банках (емкостью 0,5 л) с обычной водопроводной водой. Банки закрывают полиэтиленовыми крышками, в которых пробито по 10 отверстий диаметром 5-7 мм. Семена овощных бобов замачивают на 1 день в 0,5%-ном растворе марганцовки. Затем семена размещают ровным слоем на противень со стенками высотой 5-6 см, засыпают смесью древесных опилок и стружки и ставят на стеллаж. После появления семядольных листьев растения высаживают в отверстия крышки, сохраняя одно незанятым для полива, банки ставят на тот же стеллаж и заселяют бобы виковой тлей, раскладывая кусочки листьев с тлей (Бондаренко Н.В., Воронова О.В., 1989). Разведение пятнистой оранжерейной тли осуществляли таким же образом, как и виковой.
2.1.4 Разведение галлицы
Разведение галлицы проводили по методике Бондаренко Н.В., Асякина Б.П., 1975 г. Для получения яйцекладок галлицы, в садках размером 35Ч35Ч35 см постоянно поддерживали высокую плотность популяции имаго галлиц. Для этого 2 раза в неделю в садки помещали коконы (1-2 тысячи). Затем в каждую секцию на 1 день помещали 2-3 банки с бобами, заселенными виковой тлей. Кроме того, в садки помещали чашки Петри с кусочком поролона, поставленные в каждую секцию садка, наливали 10 %-ный сахарный сироп.
Вынутые из садка банки с растениями, на которых отложены яйца галлиц, переносили на стеллаж на 3 дня до полного отрождения личинок. Отрождающиеся личинки питались тлями, находящимися на растениях.
Потом просеянный и обеззараженный влажный песок насыпали на дно кристаллизатора слоем 1 см. Срезали с трех-шести банок растения (в зависимости от численности личинок) и выкладывали на поверхность песка. Затем накрывали рамкой затянутой капроновой тканью, чтобы тли не расползались. Ежедневно, в течение семи последующих суток в кристаллизатор добавляли для питания личинок растения с тлями. Через 5 суток после окукливания, точнее ухода личинок в песок, с его поверхности удаляли все остатки растений, а затем отделяли коконы. Для этого просеивали песок с коконами через сито (с отверстиями 1 мм).
2.1.4.1 Оценка влияния микробиологических препаратов на пятнистую оранжерейную тлю в лабораторных условиях
Препараты применялись в концентрации 0,1%, 0,2%. Обработку проводили ручным лабораторным пульверизатором. Каждый вариант опыта закладывали в 5 повторностях. В опыте мы использовали пластиковые контейнеры, которые накрывали тканью с отверстием посередине и сажали в него росток боба и кисточкой подсаживали тлю. На каждом растении находилось в среднем по 9-10 личинок тли старшего возраста. Контролем служили тли, обработанные водой (влажный контроль). Обрабатывали ростки бобов с тлей и ламповое стекло, которым накрывали ростки. После обработки ламповое стекло накрывали двойным слоем марли. Подсчет тли проводили через день, подсчитывая число тли в каждом варианте. В таблицу вносили данные в % по отношению к первому дню, в который проводили обработку, т.е. число тли в первый день принимали за 100% во всех вариантах, а в последующие дни учета численность тли сравнивали с первым днем и вычисляли по формуле: , где Х - % выживших тлей по отношению к первоначальному числу тли; А - число тли на день учета, шт.; В - общее число обработанной тли каждого варианта, шт. Обработку проводили в фазу личинок 3 возраста тли. Также вычисляли скорость нарастания популяции тли по формуле: , где InA - численность тли в день А, InB - численность тли в день В, n - количество дней.
Оценка влияния микробиологических препаратов на пятнистую оранжерейную тлю проводилась в лаборатории биологического метода защиты растений №7, ВИЗР.
2.1.4.2 Оценка влияния препаратов S-100кр. и П-56-1 на галлицу Aphidoletes aphidimyza Rond
Препараты применяли в опытах в концентрациях, которые предполагается использовать в производственных условиях защищенного грунта, в борьбе с тлями. Это позволило в лабораторных условиях создавать токсический фон, адекватный фону для оценки выживания галлиц, после обработки препаратами в защищенном грунте. Обработки разных стадий развития насекомого проводили ручным лабораторным пульверизатором.
Образцы препаратов, приготовленные на основе Streptomyces sp. П-56-1 и S-100кр. (далее препараты П-56-1, S-100кр.) по параметрам острой токсичности, относятся к веществам III класса опасности.
Оценка влияния препаратов П-56-1 и S-100кр. на Aphidoletes aphidimyza Rond. проводилась в лаборатории биологического метода защиты растений №7, ВИЗР. Обработку проводили на фазах: яйцо, личинки 2 возраста, имаго и куколки галлицы.
Обработка яйцекладок
Суточные яйцекладки галлицы помещали на ростки бобов, заселенные виковой тлей, растущие в круглых контейнерах диаметром 10 см. Затем ростки с яйцекладками накрывали ламповым стеклом, предварительно обработав ламповое стекло и яйцекладки на растениях препаратами. В варианте с каждым препаратом П-56 и S-100 было 5 повторностей. Контроль был обработан чистой водой - 5 повторностей.
После обработки ламповое стекло закрывали двойным слоем марли. Выживаемость яйцекладок оценивали по вылету имаго. Для этого выкармливали отродившихся личинок, ежедневно подсыпая в контейнеры виковую тлю. Подсчет имаго во время лета проводили ежедневно.
Обработка личинок галлицы
Личинок 2 возраста помещали тонкой кисточкой на ростки бобов, заселенных виковой тлей, в пластиковые контейнеры. Контейнеры закрывали ламповым стеклом. Предварительно обработав личинок и ламповое стекло препаратами также как в эксперименте с яйцекладками. Ламповое стекло закрывали двойным слоем марли. Личинок выкармливали до имаго, подсыпая ежедневно до окукливания виковую тлю. Учет численности насекомых проводили по вылету имаго.
Обработка коконов галлицы
Коконы галлицы помещали в пластиковые чашки Петри, на дно которых клали фильтровальную бумагу - по 60 штук в опыте и в контроле. В опыте использовали свежие коконы, только что окуклившиеся личинки, и коконы после хранения в холодильнике в течение 10 дней, где куколка уже образовалась. Проводили обработку препаратами П-56-1 и S-100кр. в двух повторностях на свежих и старых коконах, в контроле одна повторность.
Обработка имаго галлицы
В этом эксперименте сначала обрабатывали контейнеры с тлей и ламповое стекло. Имаго выпускали после того, как влага испарится (т.к. имаго галлицы очень чувствительны к капельной жидкости).
Затем имаго (6 особей), при помощи эксгаустера помещали в пластиковые контейнеры с бобами заселенные тлей, заранее обработанные. Учитывали смертность каждый день, после обработки до полной гибели имаго. Затем рассчитывали среднюю продолжительность жизни имаго в каждом варианте. Также оценивали плодовитость имаго.
Долю погибших после обработки особей галлицы определяли по формуле: , где N - общее число обработанных особей, В - число погибших особей. Ошибку вычисляли по формуле: , где р - доля погибших после обработки особей галлицы, в %, N - общее число обработанных особей, шт.Для статистического анализа использовали T-критерий Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1973; Доспехов Б.А., 1979). 3. Результаты и обсуждение3.1 Оценка влияния микробиологических препаратов на выживаемость и развитие пятнистой оранжерейной тлиВ данном эксперименте мы наблюдаем небольшое снижение численности тли только в вариантах с препаратами S-100, П-56 (табл. 1). Наибольшую биологическую эффективность наблюдаем в варианте с препаратом S-100, которая составляет 34,1%. В варианте с препаратом П-56 она составляет 15%. Остальные варианты практически не отличаются от контроля (табл.1). В дальнейшем (на 5 и 8 день учета) мы наблюдаем, рост популяции пятнистой оранжерейной тли во всех вариантах. Однако скорость нарастания в варианте с S-100 несколько ниже (R=0.32) по сравнению с контролем (R=0.33). В то же время скорость нарастания популяции в вариантах с препаратами 729, П-55 и 925 выше, чем в контроле R=0.39; 0,34; 0,33 соответственно. Это может означать, что биологически активные вещества актиномицетов влияют на репродуктивный потенциал тли и в сторону увеличения и в сторону уменьшения. Исходя из результатов опыта, мы выбрали для дальнейших испытаний два препарата: S-100 и П-56.Таблица 1Изменение численности пятнистой оранжерейной тли после обработки микробиологическими препаратами с концентрацией 0,1%Вариант опыта | Численность пятнистой оранжерейной тли по отношению к первому учетному дню,% | ||||
1 день | 2 день | 5 день | 8 день | ||
контроль | 100 | 106.2±3,2 | 301.5±17,7 | 1110.9±39,7 | |
S-100 | 100 | 65.9±6,9 | 200±10,3 | 623±33,3 | |
729 | 100 | 94.2±4,0 | 337.1±26,0 | 1474.2±39,2 | |
П-55 | 100 | 105±2,9 | 325.4±19,5 | 823.7±35,0 | |
П-56 | 100 | 85±6,2 | 312.5±23,0 | 852.5±43,3 | |
952 | 100 | 101.8±1,8 | 356.6±22,0 | 981.1±40,7 |
Вариант опыта | Численность пятнистой оранжерейной тли по отношению к 1 учетному дню, % | |||||
1 день | 2 день | 4 день | 5 день | 7 день | ||
контроль | 100 | 112,3 ± 5,3 | 285,4 ± 31,0 | 385,5 ± 44,7 | 958,5 ± 122,3 | |
S-100 | 100 | 68,6 ± 6,7 | 262,5 ± 32,6 | 350 ± 46,7 | 750 ± 110,4 | |
П-56 | 100 | 79,1 ± 5,9 | 194,7 ± 22,0 | 271,1 ± 34,9 | 734,2 ± 110,7 |
