Отметим, что протеинкиназа А в нервной ткани регулирует также чувствительность р-адренорецепторов к агонистам. Так, десенситизация этих рецепторов коррелирует с их цАМФ-зависимым фосфорилированием. Установлена также регуляция А-киназой биосинтеза самих р-агонистов. Эта регуляция осуществляется с помощью цАМФ-зависимого фосфорилирования тирозингидроксилазы - узлового фермента биосинтеза катехоламинов. Такое фосфорилирование может быть составной частью механизма ускорения биосинтеза катехоламинов в ответ на нервный импульс или секрецию нейромедиаторов в нервной ткани в условиях in vivo,
Остановимся на роли цАМФ и еще одного вторичного посредника - 2', 5'-олигоаденилата в регуляции пролиферации и дифференцировки нервных клеток. 2-5А - это олигонуклеотид, состоящий из нескольких остатков АМФ, связанных 5'-фосфодиэфирной связью. В клетке существуют 2 фермента, обеспечивающие определенный уровень 2-5А. Олигосинтетаза - фермент биосинтеза 2-5А, активен лишь в присутствии двуспиральной РНК; молекулярная масса - 100-105 кД. 2'-Фосфодиэстераза гкдролизует 2-5А до АМФ и АТФ, молекулярная масса этого фермента около 40 кД.
Чтобы оценить биохимическое и физиологическое значение процессов образования 2-5А, необходимо остановиться на механизмах подавляющего влияния цАМФ на пролиферативный статус нервных клеток. Так, действие ряда факторов, в частности фактора роста нервов, а также повышение уровня цАМФ, вызванное теофиллином или дибутирил-цАМФ, приводит к остановке деления и дифференцировке этих клеток. Действие теофиллина в отличие от фактора роста нервов или дибутирильного аналога цАМФ носит кратковременный характер. Повышение концентрации цАМФ в результате ингибирования фосфодиэстеразы под действием теофиллина, как и в случае фактора роста нервов и дибутирил-цАМФ, приводит к блокаде активного деления и дифференцировке нервных клеток. Однако в дальнейшем падение активности фосфодиэстеразы, обусловленное теофиллином, и соответствующее увеличение уровня цАМФ компенсируется индукцией биосинтеза этого фермента. Именно этим и объясняется кратковременное действие теофиллина.
Повышение уровня цАМФ в нервных клетках, вызванное действием факторов, непосредственно влияющих на аденилатциклазную систему, сопровождается более чем 10-кратным увеличением концентрации 2-5А. Установлено, что рост уровня олиго синтетазы и концентрации 2-5А наблюдается при дифференцировке клеток и замедлении клеточного деления.
Исследование биологических свойств 2-5А показало, что этот олигоиуклеид способен обратимо активировать специфическую латентную нуклеазу, ускорять гидролиз РНК и, таким образом, ингибировать синтез белка in vivo и тормозить процесс размножения клеток. Следовательно, повышение уровня 2-5А и изменение концентрации цАМФ является частью универсального механизма регуляции клеточного деления. К настоящему времени установлены два взаимодополняющих процесса, с помощью которых осуществляются эти регуляторные реакции. С одной стороны, стимуляция А-киназы при повышении уровня цАМФ приводит к фосфорилированию белка сМг - 18 кД. Этот белок в виде фосфоформы является ингибитором активности 2' - фосфодиэстеразы - фермента гидролиза 2-5А. С другой стороны, повышение концентрации цАМФ внутри клетки вызывает индукцию олиго синтетазы. осуществляющей синтез 2-5А.
Совокупность этих событий приводит к устойчивому повышению уровня 2-5А и связанному с этим переходу нервных клеток в состояние покоя. По-видимому, именно таким образом осуществляется ярко выраженный антинролиферативный эффект цАМФ, вызванный действием этого вторичного посредника на систему метаболизма 2-5А. При этом взаимное влияние уровней цАМФ и 2-5А основано на механизме отрицательной обратной связи. Так, установлено, что подъем уровня 2-5А, обусловленный увеличением внутриклеточной концентрации цАМФ по указанным механизмам, в свою очередь, способствует активации фосфодиэстеразы цАМФ. В результате происходит снижение уровня цАМФ и прекращение роста концентрации 2-5А, который является в этом случае вторичным посредником в проявлении антипролифера-тивного действия цАМФ.
1.3 Фосфодиэстераза
В прекращении сигнала цАМФ участвуют фосфодиэстераза, гидролизующая этот нуклеотид до АМФ. В противоположность аденилатциклазе фосфодиэстераза - преимущественно растворимый фермент. В то же время активность фермента обнаружена во фракциях саркоплазматического ретикулума, митохондрий и ядер.
Циклонуклеотидактивируемая фосфодиэстераза гидролизует как цАМФ, так и цГМФ, при этом под действием цГМФ ускоряется гидролиз цАМФ и наоборот, что свидетельствует о положительной кооперативности двух активных центров. Несомненна роль фермента в проведении нервного импульса: так, в постсинаптической мембране нервной ткани обнаружен необычайно высокий уровень фосфодиэстеразы цГМФ.
Для фосфодиэстеразы характерно наличие множественных форм. Эти формы различаются как по молекулярной массе, так и по сродству к одному и тому же и к различным циклическим нуклеотидам. В целом, сродство к циклическим нуклеотидам у фосфодиэстераз в 100-1000 раз ниже, чем у протеинкиназ А и G, поэтому при ускорении синтеза нуклеотидов сначала происходит насыщение циклическими нуклеотидами регуляторных центров киназ и лишь затем - гидролиз цАМФ и цГМФ фосфодиэстеразами.
В мозге содержатся Са-кальмодулинрегулируемые формы как цАМФ-синтезирующего, так и цАМФ-гидролизующего ферментов. Са-кальмодулинзависимая фосфодиэстераза представляет собой гомодимер, состоящий из субъединиц с различной молекулярной массой у разных изоформ фермента. Ограниченный протеолиз субъединицы 60 кД приводит к появлению фрагмента с Мг = 36 кД и необратимой активации фосфодиэстеразы. Фрагмент 36 кД более не активируется кальмодулином. Следовательно, субъединицы фосфодиэстеразы включают 2 фрагмента: каталитический и регуляторный.
Анализ регуляторных свойств фосфодиэстеразы в нервной ткани свидетельствует о тесном сопряжении между цАМФ- и Са-зависимыми системами внутриклеточной сигнализации; это сопряжение может модулироваться с помощью изоферментов фосфодиэстеразы. Так, в мозге быка найдены 2 изоформы Са-КМ-зависимой фосфодиэстеразы, состоящей из субъединиц с Мг = 60 и 63 кД. Изофермент с субъединицами 60 кД может быть фосфорилирован цАМФ-зависимой протеинкиназой, что приводит к уменьшению сродства фосфодиэстеразы к кальмодулину. Дефосфорилирование этого изофермента осуществляет Са-КМ-стимулируемая протеинфосфатаза; при этом восстанавливается чувствительность фосфодиэстеразы к кальмодулину.
В отличие от изофермента с субъединицами 60 кД фосфорилирование изоформы фосфодиэстеразы с субъединицами 63 кД осуществляется Са-КМ-зависимыми протеинкиназами. Это фосфорилирование также приводит к потере чувствительности фосфодиэстеразы к кальмодулину и "обращается" Са-КМ-стимулируемой протеинфосфатазой с восстановлением чувствительности фосфодиэстеразы к КМ. Очевидно, такой механизм регуляции фосфодиэстеразы реализуется в мозге in vivo, несмотря на очень высокую, "насыщающую" концентрацию в нем КМ. Фосфорирование снижает сродство фермента к КМ и обусловливает зависимость его активности от физиологических концентраций Са+.
В нервной ткани, таким образом, существует тесная взаимосвязь между двумя системами вторичных посредников, Са+ и цАМФ, осуществляемая посредством цАМФ- и Са-зависимого фосфорилирования-дефосфорилирования различных изоферментов фосфодиэстеразы цАМФ. Эта взаимосвязь может модулироваться также различным сродством к Са+ аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, протеинкиназы и фосфатазы. Так, аденилатциклаза мозга активируется гораздо более низкими концентрациями Са чем фосфодиэстераза.
Кроме циклических нуклеотидов, Са+ и ограниченного протеолиза фосфодиэстеразу активируют также полианионы, фосфолипиды, жирные кислоты. Ингибиторами или активаторами фермента являются многочисленные фармакологические вещества. Фосфодиэстераза является более "удобной" мишенью для действия лекарственных препаратов, чем аденилатциклаза, так как менее специфична в отношении эффекторных влияний. Мощными ингибиторами фосфодиэстеразы являются производные ксантинов - ингибирование осуществляется блокадой аллостерического центра связывание нуклеотидов.
2. цГМФ-зависимое протеинфосфорилирование
Вскоре после открытия цАМФ-зависимых протенкиназ был обнаружен еще один класс циклонуклеотидзависимых фосфорилирующих ферментов, стимулируемых с помощью цГМФ, - протеинкиназы G. В тканях млекопитающих содержание протеинкиназ G весьма невелико. Наиболее высок уровень активности и содержания протеинкиназ G в мозжечке, сердечной мышце и легких, эти же ткани содержат и наибольшее количество цГМФ, не превышающее, впрочем, 10% от содержания в них цАМФ. Основное количество протеинкиназы G обнаружено в цитозоле, некоторая часть фермента связана с цитоплазматическими мембранами и ядерной фракцией.
Фермент состоит из двух примерно идентичных субъединиц, каждая из которых имеет каталитическую активность и способна связывать циклический нуклеотид. Ограниченным протеолизом можно перевести димер в мономеры и затем разделить каждую субъединицу на цГМФ-связывающий и каталитический фрагменты. Эти исследования наряду с выявленной гомологией между протеинкиназой G и протеинкиназой А II типа по субстратной специфичности, аминокислотной последовательности, способности к аутофосфорилированию, иммунологическим свойствам привели к представлению о том, что цАМФ и цГМФ-зависимые протеинкиназы эволюционировали от общего гена, кодирующего одну полипептидную цепь. В процессе развития цАМФ-зависимый фермент стал синтезироваться в виде разобщенных компонентов, тогда как цГМФ-зависимая протеинкиназа синтезируется как одна цепь.
В отличие от каталитической субъединицы протеинкиназы А, способной высвобождаться во время активации фермента, внутриклеточное перемещение "недиссоциированной" протеинкиназы G может быть затруднен. На основании аминокислотного анализа протеинкиназы G было установлено, что одна субъединица фермента содержит два центра связывания нуклеотида.
Регуляторная N-концевая половина молекулы протеинкиназы G сходна с семейством цАМФ-связывающих белков, в то время как каталитическая Сконцевая половина родственна группе киназ с различной специфичностью. Протеинкиназа G способна к аутофосфорилированию из расчета 2 моля фосфата на 1 моль холофермента. Аутофосфорилирование не изменяет сродства к цГМФ и незначительно повышает Vmakc фосфотрансферазной реакции, но заметно увеличивает сродство протеинкиназы G к цАМФ. Таким образом, аутофосфорилирование может обусловливать регуляцию протеинкиназы G не только с помощью цГМФ, но и цАМФ.
Протеинкиназа G фосфорилирует, вероятно, те же аминокислотные остатки в молекуле субстрата, что и протеинкиназа А, но с гораздо меньшей скоростью. Различная скорость фосфорилирования протеинкиназ А и G может являться основой их субстратной специфичности.
Как упоминалось, наибольшее содержание протеинкиназы G в нервной ткани отмечено в мозжечке. В свою очередь, в этом отделе мозга фермент локализован в клетках Пуркинье. Найдена корреляция между увеличением содержания G-киназ в цитоплазме клеток Пуркинье, началом роста дендритов и установлением синаптических контактов в клетках Пуркинье и подобных им субкортикальных клетках, что может свидетельствовать в пользу безусловной значимости цГМФ-зависимого фосфорилирования для нейрональной дифференцировки этих клеток. В клетках Пуркинье находится и единственный в мозге млекопитающих специфичный субстрат для протеинкиназы G, названный G-субстратом; G-субстрат - кислоторастворимый и термостабильный белок с Мг = 23 кД. Обнаружено, что фосфорилированный с помощью цГМФ-зависимой протеинкиназы G-субстрат ингибирует протеинфосфатазу, выделенную из мозжечка, являясь специфичным для клеток Пуркинье протеинфосфатазным ингибитором. При этом ингибируемая фосфатаза из этих клеток, вероятно, катализирует дефосфорилирование белков, не являющихся субстратами протеинкиназы А.
Увеличение уровня цГМФ обусловлено взаимодействием с плазмалеммой различных гормонов и нейромедиаторов. Так активируется связанная с мускариновыми рецепторами гуанилатциклаза Активация гуанилатциклазы обычно обусловлена мобилизацией Са+ из эндоплазматического ретикулума.
В клетках мозга обнаружен термостабильный белок, стимулирующий активность протеинкиназы G, но не изменяющий активность протеинкиназы А. Обратный процесс - инактивация протеинкиназы G состоит в гидролизе цГМФ фосфодиэстеразой, специфичной для этого нуклеотида. Кроме того, в тканях млекопитающих, в том числе и нервной, найден ингибитор G-киназы с Мг = 15 кД.
Отметим, что системы циклических нуклеотидов осуществляют внутриклеточную регуляцию в тесном взаимодействии друг с другом. Так, например, если концентрация цАМФ в клетке длительное время повышена, может происходить фосфорилирование белков, встроенных в каналы плазматической мембраны, что приводит к повышению в цитоплазме концентрации Са+. В результате этого активируются фосфодиэстераза и гуанилатциклаза; соответственно ускоряется гидролиз цАМФ и образуется цГМФ.
Итак, цГМФ играет важную роль в нервной системе, особенно в клетках Пуркинье мозжечка. Об этом свидетельствует избирательная локализация в этих клетках всех компонентов системы цГМФ, включая гуанилатциклазу, протеинкиназу G и G-субстрат. Различные нейромедиаторы, в том числе ацетилхолин, вызывают увеличение уровня цГМФ в клетках Пуркинье и активацию G-киназы, что, по всей видимости, модулирует такие свойства этих клеток, как скорость проведения возбуждения и способность к стимуляции.
Установлено также, что цГМФ модулирует активность ионных каналов мембран нервных клеток. Так, введение в нейроны улитки цГМФ или G-киназы увеличивает проводимость Са-каналов.
3. Са-кальмодулинзависимое протеинфосфорилирование
Как упоминалось, в процессе эволюции выработались эффективные механизмы удаления Са+ во внеклеточное пространство или специализированные внутриклеточные структуры. Низкая внутриклеточная концентрация Са+ позволила клеткам использовать "впрыскивание" Са+ в цитоплазму как сигнал на внешние воздействия. При этом кальций может быть даже более универсальным внутриклеточным регулятором, чем цЛМФ. Так, период действия Са+ очень короток и измеряется миллисекундами, а не секундами, как в случае цАМФ. Как стало понятно в последнее время, обе системы вторичных посредников функционируют в тесном взаимодействии.
Для внутриклеточной "реализации" кальциевого сигнала в процессе эволюции созданы специальные внутриклеточные белковые рецепторы Са+, способные опосредовать действие этого иона на молекулярные мишени. Основным рецептором Са+ во всех клетках является кальмодулин. Кальмодулин - глобулярный белок сМг - 16,5 кД. Структурно он очень консервативен: так, обнаружено только шесть или немногим более аминокислотных замен в кальмодулине, выделенном из живых объектов, эволюционно разделенных миллионами лет. Кальмодулин содержит 4 Са-связывающих участка: в состав каждого из этих участков входят кислые остатки аминокислот, необходимые для связывания Са+ и обусловливающие низкое значение изоэлектрической точки KM. Фосфорилированных форм КМ не обнаружено.
Кальмодулин локализован главным образом в цитоплазме, а также ассоциирован с различными клеточными структурами, микротрубочками и мембранами, включая постсинаптические мембраны. Внутриклеточное распределение КМ регулируется циклическими нуклеотидами. Так, цАМФ-зависимый транспорт Са+ через клеточные мембраны может изменять сродство КМ к мембранной и цитоплазматической фракциям клетки.
При стимулировании происходит связывание Са+ с КМ. В результате кальмодулин претерпевает конформационные изменения: экспонирование гидрофобного участка при этом - важное условие для последующего взаимодействия КМ с акцепторными белками. Среди ферментов-исполнителей, активность которых модулируется в присутствии КМ, непосредственное отношение к регуляторным реакциям внутриклеточного протеинфосфорилирования имеют Са-КМ-зависимые протеинкиназы, аденилатциклаза, фосфодиэстераза циклических нуклеотидов и КМ-зависимая протеинфосфатаза.
На первый взгляд, способность КМ во многих тканях активировать системы как синтеза, так и деградации цАМФ выглядит парадоксом. Однако локализация ферментов аденилатциклазы в мембране, а фосфодиэстеразы в интозоле обусловливает преимущественную Са-активацию аденилатциклазы. Кроме того, для полной активации аденилатциклазы достаточно комплекса КМ-Са+, а для фосфодиэстеразы необходимо заполнение третьего, а возможно, и четвертого Са-связывающего участка КМ. Это означает, что аденилатциклаза активируется при более низких концентрациях Са+.
Результатом действия Са+ и кальмодулина часто является фосфорилирование, катализируемое Са-КМ-зависимыми протеинкиназами. К настоящему времени обнаружено 3 тина КМ-зависимых протеинкиназ В, которые в порядке убывания молекулярной массы обозначаются как протеинкиназы В I, II и III. Основные различия этих типов протеинкиназы В относятся к их субстратной специфичности. Так, протеинкиназа В I типа фос-форилирует лишь несколько белков в нервной ткани, в то же время для киназы II типа только в головном мозге найдено более 10 субстратов. Сродство этих протеинкиназ к КМ практически одинаково, что свидетельствует об одинаковой структуре КМ-узнающего участка фермента.
В нервной ткани, где концентрация Са-КМ-зависимых протеинкиназ особенно высока, обнаружены специфические изоферменты В-киназ I и II типа. Так, в мозге быка найдено, по меньшей мере, 3 изофермента В-киназы I типа. Высокомолекулярные олигомерные В Н-киназы из лобных долей мозга и мозжечка отличаются по субъединичному составу. Если первый фермент состоит из субъединиц а и р с Мг = 50/55 и 60/65 кД в молярном соотношении 3:1, то В-киназа из мозжечка имеет другое соотношение этих субъединиц - 1:4. Гетерогенность и высокая концентрация В-киназ в нервной ткани может обусловливать физиологическую значимость Са-КМ-зависимого фосфорилирования в клетках нервной системы.
Как установлено, протеинкиназа В II типа составляет примерно 0,4% от общего белка головного мозга млекопитающих, что свидетельствует о важной регуляторной роли фермента в этом отделе ЦНС. В-киназа II типа преимущественно связана с мембранной фракцией в отличие от "цитоплазматической" киназы В I типа. Мембраносвязанный фермент II типа сконцентрирован в области постсинаптического уплотнения в тех отделах нервной системы, которые связаны с обучением. Киназа В II типа обладает свойствами двухфазного переключателя со стабильностью, необходимой для кодирования долговременной памяти.
КМ-зависимые протеинкиназы могут быть разделены на 2 группы по структурным особенностям. Так, в одной группе КМ является интегральной частью фермента, а в другой - способен обратимо диссоциировать от протеинкиназы. Примером первого случая может служить киназа фосфорилазы, [Три активации фермента Са+ связывается с субъединицей фермента, являющейся кальмодулином. Около 20 лет назад было обнаружено стимулирующее действие на киназу фосфорилазы протеинкиназы А. К настоящему времени установлено, что 10-20 кратное увеличение активности фермента может быть вызвано цГМФ-зависимой и КМ-зависимой протеинкиназами. Участие экзогенного КМ в регуляции активности киназы фосфорилазы происходит только при отсутствии стимулов, приводящих к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ. Гликоген и ферменты его метаболизма присутствуют в глии и нейронах: электростимулируемое расщепление гликогена в нервной ткани регулируется посредством активации киназы фосфорилазы.
