3.2 Стоп-сигналы переноса
Для неотщепляемых сигнальных последовательностей, которые играют роль N-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Отсюда следует, что перенос может останавливаться просто при наличии протяженного гидрофобного участка, который способен образовать трансмембранную б-спираль. В пользу тассского предположения свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Например, с помощью рекомбинантной ДНК в среднюю часть белка Е.coli, в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Если их длина была не менее 16 аминокислотных остатков, то транспорт белка блокировался, и он оставался присоединенным к плазматической мембране. Можно возразить, что в данном случае речь идет о бактериальной системе, но все-таки механизмы переноса в про- и эукариотических системах сходны. Далее были сконструированы варианты G-белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Длина гидрофобного сегмента могла составлять не 20, а 8 остатков, при этом полипептид оставался трансмембранным, хотя транспорт в плазматическую мембрану блокировался. Таким образом, природа стоп-сигнала переноса точно не известна. Необходимо выяснить два вопроса: 1) участвуют ли в остановке переноса специфические белки аппарата переноса; 2) определяется ли остановка переноса гидрофобностью стоп-сигнала или какими-то более тонкими факторами? Было показано, что участки стоп-сигнальной последовательности, ответственные за блокирование переноса через эндоплазматический ретикулум, могут никак не влиять на транспорт через мембрану хлоропласта. Это означает, что упомянутые два процесса могут существенно различаться.
Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом. Следовательно, важна не только природа самих стоп- или старт-последовательностей, но и их окружение в полипептиде.
3.3 Использование синтетических сигнальных пептидов
Синтезированы пептиды, соответствующие сигнальной последовательности дикого типа, а также мутантные сигнальные пептиды белка LamB наружной мембраны и исследовано их взаимодействие с модельными фосфолипидными мембранами и везикулами Е.coli. Показано, что пептид, соответствующий сигнальной последовательности дикого типа, эффективно ингибирует in vitro перенос предшественников как периплазматичекого белка, так и белка наружной мембраны, а пептид, соответствующий мутантной сигнальной последовательности, дефектной по экспорту, не ингибирует перенос в бесклеточной системе. Это означает, что сигнальные пептиды узнают какой-то общий рецептор в цитозольной или мембранной фракции. Кроме того, эффективность связывания этих пептидов с модельными мембранами (монослоем и бислоем) коррелирует с их способностью служить сигналом переноса. Корреляция между гидрофобностью сигнальной последовательности и способностью инициировать транслокацию обнаруживается и при использовании предшественника мальтозосвязывающего белка.
Эти данные согласуются с моделью, согласно которой первичная сигнальная последовательность определяет локализацию полипептидного предшественника в мембране путем неспецифических взаимодействий с липидным бислоем, после чего осуществляется более специфическое связывание с белковым рецептором. Сходная модель была предложена для амфифильных пептидных гормонов. Но сигнальный пептид в животных клетках до его связывания с мембраной взаимодействует с каким-то растворимым рецептором. Какое значение для сигнального пептида имеет его способность связываться с липидами - остается неясным.
3.4 Сигнальные пептидазы
Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е.coli. Большинство экспортируемых белков Е.coli содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис.2.
Рис.2. Предполагаемая топология лидер-пептидазы из Е.coli.
Аминокислотные остатки пронумерованы. Прямоугольниками обозначены гидрофобные сегменты. Первый гидрофобный участок не был обнаружен экспериментально, вывод о его существовании был сделан исходя из его гидрофобности. Наличие и ориентация второго гидрофобного участка установлены экспериментально и, по-видимому, он функционирует как внутренняя сигнальная последовательность. Третий гидрофобный сегмент имеет слабо выраженный гидрофобный характер и является частью периплазматического домена.
Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. In vitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления. Сигнальная пептидаза, функционирующая в эндоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е.coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.
У Е.coli имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е.coli замечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеиновая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембраносвязанного фермента протеазы ЙV.
В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте. Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.
4. Растворимые и мембраносвязанные белки, необходимые для
переноса
Идентифицировано несколько цитозольных и мембраносвязанных белковых компонентов, необходимых для переноса. Наиболее детально охарактеризованы белковые факторы, участвующие во встраивании белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих (рис.3).
1. Сигнал-распознающая частица (СРЧ). Это растворимый рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы 7S-РНК. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1нМ. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полипептидов (54 кДа), непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo. Одна из вероятных функции СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос (например, из-за экранирования сигнальных последовательностей). Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.
Рис.3. Схематическое изображение ранних стадий котрансляционного переноса полипептида через эндоплазматический ретикулум млекопитающих.
Сигнал-распознающая частица и СРЧ-рецептор (стыковой белок) хорошо охарактеризованы. Мембраносвязывающий сигнальный рецептор изображен как компонент канала через мембрану, но существование таких каналов и роль сигнального рецептора не бесспорны. После образования комплекса между сигнальным пептидом и мембраносвязанным рецептором на стадии 3 СРЧ и стыковочный белок могут диссоциировать и принимать участие в новом цикле, оставляя мембраносвязанную рибосому и образовавшуюся цепь присоединенными к аппарату переноса.
Некоторые небольшие белки (<8,5 кДа) транспортируются в эндоплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромеллитин (оба они являются предшественниками секретируемых белков) и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствии СРЧ и рибосом.
2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ, называемым также стыковочным белком. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с молекулярной массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране.
3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности (45 кДа). Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мембраносвязанным рецепторм, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего неизвестно; очистка его является довольно сложной задачей.
5. Сборка мультисубъединичных комплексов и обновление
мембранных белков
После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультисубъединичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалентные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование дисульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформационного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.
Например, у Е.coli четко наблюдается сборка стабильных тримеров обоих белков, LamB и OmpF, после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. В эукариотических клетках гликопротеин гемагглютинина вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме. Несвернутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7-10 мин. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита.
Сборка многих субъединичных комплексов, содержащих разные субъединицы, тоже, по-видимому, происходит в эндоплазматическом ретикулуме. Примером служит никотиновый ацетилхолиновый рецептор, который содержит две б-субъединицы и по одной в-, г- и д-субъединице (рис.4).
Рис.4. Модель канала никотинового ацетилхолинового рецептора.
Показаны общий вид канала и его расположение в мембране, отмечены участки гликозилирования с наружной стороны и места связывания ацетилхолина на б-субъединицах.
С помощью антител можно различить отдельные формы б-субъединицы: 1) начальный продукт, встраивающийся в эндоплазматический ретикулум; эта форма не может связывать антагонист б-бунгаротоксин; 2) форма, способная связываться с б-бунгаротоксином и образующаяся через несколько минут после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 3) зрелый рецептор, содержащий все субъединицы (б2вгд), который обнаруживается через 15мин после завершения трансляции в эндоплазматическом ретикулуме; 4) готовый рецептор на клеточной поверхности, появляющийся спустя примерно 2ч после трансляции. Созревание включает образование дисульфидных связей, олигосахаридный процессинг и ацилирование при участии жирных кислот. Вероятно, определенную роль в сборке, происходящей в комплексе Гольджи, играет фосфорилирование субъединиц.
Решающим фактором процесса сборки является, вероятно, стабильность таких стехиометрических комплексов, как ацетилхолиновый рецептор. По-видимому, в некоторых системах отдельные субъединицы синтезируются в значительном избытке и не образуют стабильных комплексов, а подвергаются протеолитическому расщеплению.
Изучался также процесс созревания и сборки структуры, образующей Na-канал. Необходимым условием созревания является образование дисульфидной связи между б- и в2-субъединицами, однако, это событие происходит спустя примерно 1ч после трансляции и транспорта субъединиц в аппарат Гольджи, а рецептор появляется на клеточной поверхности через 4ч после трансляции. В этом случае свободные б- субъединицы не подвергаются быстрой деградации, а сохраняются в межклеточном пуле и, возможно, используются в дальнейшем в качестве предшественников для формирования канала в растущих нейронах.
Созревшие мембранные белки подвергаются непрерывному обновлению. Период полуобновления Na-канала составляет около 30ч, что типично для поверхностных белков. Обновление большой субъединицы Na/К-АТРазы в растущих клетках в культуре происходит за время 20-40ч. По-видимому, деградация по крайней мере некоторых белков происходит в лизосомах.
Примеры обновления мембранных белков
Стабильность белков в клетке определяется множеством различных факторов. Особенно интересным примером деградации мембранных белков является гидроксиметилглутарил-СоА-редуктаза. Этот фермент находится в гладком эндоплазматическом ретикулуме и регулирует эндогенный синтез холестерола. Деградация его происходит довольно быстро (~2-4ч) и ускоряется при взаимодействии с холестеролом. Для ускорения процесса необходимо наличие мембраносвязанного домена фермента. При определенных условиях в культуре ооцитов китайского хомячка наблюдается сверхпродукция (более 500раз) этого фермента. В результате образуются мембранные трубочки, занимающие 15% клеточного объема и содержащие другие мембранные белки, а также липиды. Добавление холестерола приводит к быстрой деградации избытка мембран, что говорит о координации синтеза и деградации мембранных компонентов.
Другим интересным примером селективного метаболизма мембранных белков является гербицидсвязывающий белок (называемый также белком Dl или QВ) с молекулярной массой 32 кДа из тилакоидов хлоропластов. Этот белок синтезируется как предшественник, созревая внутри отдельных ламелл тилакоида, не собранных в граны, и является частью фотосистемы ЙЙ в ламеллах, входящих в граны. На свету скорость деградации этого полипептида в мембране намного выше, чем других белков. Причина этого явления неизвестна; возможно, оно связано с тем, что в фотосистеме ЙЙ на свету происходят какие-то повреждения.
Выводы
Клетки эукариот содержат много мембранных органелл и множество различных внутриклеточных мембран, каждая из которых обладает уникальным белковым составом. Любой мембранный белок, информация о синтезе которого заключена в ядре, должен безошибочно доставляться от места синтеза на рибосоме, находящейся в цитоплазме, к месту назначения. Для этого используется сложная система сигнальных последовательностей, содержащихся в любой зрелой форме полипептида или предшественника, а также рецепторы внутри клетки, способные эти сигналы распознать. Некоторые мембранные белки включаются в липидный бислой самопроизвольно, но в большинстве случаев правильная сборка белка внутри клеточной мембраны является энергозависимым процессом, который осуществляется с помощью специализированного аппарата. По-видимому, белки не могут включиться в клеточную мембрану до тех пор, пока они не приобретут частично развернутую конформацию. Разворачивание белков или поддержание их в развернутой конформации, необходимой для переноса, возможно, осуществляются при участии АТР и специфических белков в цитоплазме.
Литература
1. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции: Пер. с англ. - М.: Мир, 1997.
2. Мари Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах. Т.2. Пер. с англ. - М.: Мир, 1993.
3. Мецлер Д. Биохимия. Химические реакции в живой клетке: Пер. с англ. - М.: Мир, 1980.
4. Страйер Л. Биохимия: Пер. с англ. - М.: Мир, 1984. - Т.1.
Страницы: 1, 2
