Имеются данные о том, что у бактерий существуют сигналы, отличные от сигналов у Е. coli. Особый интерес представляет уникальная сигнальная последовательность, содержащаяся в бактерио-родопсине Н. halobium. Этот белок синтезируется in vivo с N-концевым сигналом длиной 13 остатков, который в принципе может образовать амфифильную а-спираль. Он сильно отличается от сигнальной последовательности Е. coli, и о его функционировании почти ничего не известно.
Сигнальные проследовательности импорта и сортировки в митохондриях
Белки митохондрий и хлоропластов, информация о которых закодирована в ядре, синтезируются в виде водорастворимых предшественников на свободных рибосомах и in vivo переносятся к месту назначения после трансляции. В результате сортировки мито-хондриальные белки оказываются в наружной мембране, межмембранном пространстве, внутренней мембране или в матриксе. Эксперименты с использованием химерных полипептидов или полипептидов, полученных в результате делеций, показали, что, как правило, достаточная для импорта и сортировки информация содержится на N-конце. Большинство белков митохондрий и хлоропластов синтезируется с N-концевыми препоследовательностя-ми, которые удаляются сигнальными пептидазами во время или после переноса. Эти препоследовательности содержат информацию, необходимую для импорта и сортировки. Например, первые 22 аминокислоты IV субъединицы цитохром с-оксидазы, присоединенные к дигидрофолатредуктазе мыши, детерминируют импорт цито-зольного фермента в матрикс митохондрий. В общем случае в отсутствие дополнительных сигналов сигнал импорта направляет белок-пассажир в матрикс. Это «укороченный» путь, аналогичный конститутивной секреции белков, импортируемых в эндоплазматический ретикулум. Дополнительные сигналы сортировки, как правило, тоже находятся в препоследовательности, за сигналом импорта. Например, если препоследовательность цитохрома с присоединена к тетрагидрофолатредуктазе, то белок-пассажир локализуется в межмембранном пространстве. Даже в тех немногих случаях, когда отщепляемая сигнальная последовательность отсутствует, сигналы сортировки и импорта находятся на N-конце полипептида. Впрочем, в некоторых работах имеются указания на то, что какую-то роль в импорте митохондриальных белков играют последовательности, отличные от тех, которые расположены вблизи N-конца.
На рис. 10.13 суммированы данные о структуре сигнальных последовательностей типичных митохондриальных белков. У всех них на N-конце находится последовательность, определяющая транспорт белков в матрикс, а также при необходимости содержится дополнительная сигнальная информация.
Белки наружной мембраиы
Наиболее детально изучен белок наружной мембраны дрожжей с мол. массой 70 кДа. Как и другие белки наружной мембраны, он не содержит отщепляемого сигнального пептида, и сигнальной последовательностью, ответственной за его транспорт в матрикс, служит N-конец. Это было показано в опытах по присоединению первых 12 аминокислот исследуемого белка к цитозольному белку, в результате чего белок-пассажир оказывался в матриксе митохондрии. Сигнал сортировки, который определяет локализацию белка мол. массой 70 кДа в наружной мембране, по-видимому, представляет собой сегмент из 28 незаряженных аминокислот, примыкающий к сигнальной последовательности, ответственной за транспорт белка в матрикс. Деления лишь двух из этих незаряженных остатков приводит к транспорту белка в матрикс. Заметим, что митохондриальный импорт, по-видимому, осуществляется через каналы, находящиеся в местах соединения внутренней и наружной мембран. В отличие от примера, приведенного на рис. 10.8, сборка белка с мол. массой 70 кДа не требует наличия трансмембранного потенциала, что типично для белков наружной мембраны. Простейшая схема сборки белка с мол. массой 70 кДа состоит в том, что гидрофобный участок, закрепляющий белок в наружной мембране, играет роль стоп-сигнала переноса, в результате основная часть белка остается вне митохондрии. Сборка другого исследованного белка наружной мембраны, порина из Neurospora crassa, вероятно, осуществляется с,помощью другого механизма. Этот белок не содержит гидрофобного участка и, подобно поринам бактерий, по-видимому, представлен трансмембранной /3-структурой.
Межмембран нов пространство
Типичным представителем белков, содержащихся в межмембранном пространстве, является цитохром Ьг. Его пре-последовательность состоит из 80 остатков, составляющих два разных участка. N-концевая часть препоследовательности служит сигналом, направляющим целый полипептид в матрикс. Этот процесс зависит от наличия потенциала на внутренней мембране. В резуль-
тате протеолитического процессинга, осуществляемого сигнальной пептидазой в матриксе, N-концевой участок препоследовательности удаляется и освобождается вторая часть сигнала, которая направляет полипептид обратно через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. Этот этап не требует наличия мембранного потенциала. В результате второго акта протеолиза на наружной поверхности внутренней мембраны образуется водорастворимая зрелая форма белка. Сходным образом происходит импорт железосе-росодержащей себъединицы Риске bci-комплекса, но в этом случае весь протеолитический процессинг осуществляется внутри матрикса. Заметим, что процесс переноса белков из матрикса очень похож на процесс экспорта белков из бактерий.
Для объяснения импорта цитохрома с,, другой субъединицы Ьс\-комплекса, были предложены два механизма. Один из них сходен с механизмом, описанным выше для цитохрома bi, другой представлен на рис. 10.14. В этом случае препоследовательность весьма протяженная и очень похожа на таковую у цитохрома Ьг. Предполагается, что белок, направляемый N-концевой сигнальной последовательностью, транспортируется в матрикс до тех пор, пока перенос не блокируется гидрофобным сегментом из 19 незаряженных остатков на С-кон-це препоследовательности. Белок закрепляется на внутренней мембране, как это схематически показано на рис. 10.14. Как только перенос цитохрома С\ прекращается, две сигнальные пептидазы, одна в матриксе, а другая в межмембранном пространстве, отщепляют препоследовательность, в результате чего образуется зрелый белок, который собирается в мультисубъединичный Ьокомплекс. Зрелый белок, вероятно, фиксируется во внутренней мембране с помощью С-концевой гидрофобной спирали. Заметим, что механизм импорта цитохрома с в межмембранное пространство, по-видимому, уникален. В этом случае отщепляемая препоследовательность отсутствует; вероятно, белок имеет свой собственный специфический рецептор.
Внутренняя мембрана
По-видимому, сигнал сортировки у многих белков внутренней мембраны, импортируемых из цитоплазмы, может быть заменен соответствующей гидрофобной последовательностью, выполняющей функции стоп-сигнала переноса. Об этом свидетельствует, в частности, локализация гибридного белка, полученного путем присоединения к карбоксильной части G-белка везикулярного стоматита сигнальной последовательности, определяющей транспорт в матрикс. Гибридный белок импортировался в митохондрию in vitro и закреплялся во внутренней мембране с помощью трансмембранного домена G-белка. Сегмент N-концевой последовательности, функционирующий как стоп-сигнал переноса во внутреннюю, но не в наружную мембрану, содержится также в ADP/ATP-переносчике.
Сигнальные последовательности в хлоропластах
Первичные сигналы сортировки хлоропластных белков, закоди-ванных в ядре, сходны с сигналами, характерными для митохондри-альных белков. Так, было показано, что препоследовательность одного из хлоропластных белков направляет белки-пассажиры в митохондрию дрожжей. Каков механизм сортировки белков по разным органеллам при наличии как хлоропла-стов, так и митохондрий -- неясно. Сортировка белков хлоропла-стов в самой органелле является даже более сложной проблемой, чем в случае митохондрий. Хлоропластные белки могут находиться в любой из двух мембран оболочки или в строме, они могут встраиваться в мембрану тилакоида или пересекать ее, проникая в полость тилакоида. Вторичные сигналы, по-видимому, локализованы внутри N-концеЕой препоследовательности в группах из отдельных доменов аналогично митохондриальным сигналам сортировки. Таким образом, для того чтобы белки, закодированные в ядре, могли попасть в полость тилакоида, необходимы по крайней мере два сигнала: один для прохождения белка через оболочку с последующим образованием растворимого предшественника в строме и второй для транспорта через мембрану тилакоида.
Структурные особенности последовательностей, ответственных за направление белков в матрикс
При сравнении сигнальных последовательностей, ответственных за транспорт белков в митохондрии, выявляется не какая-то специфическая последовательность, а скорее общая тенденция этих сигналов к образованию положительно заряженных амфифильных спиралей. Как правило, эти последовательности вообще не несут отрицательных зарядов или слабо заряжены, причем лизиновые н аргининовые остатки расположены таким образом, что при формировании а-спирали они оказываются в основном на одной из ее сторон, образуя область с четко выраженными гидрофобными свойствами. Такие амфифильные последовательности очень часто встречаются в растворимых белках. Показано, что внутренние последовательности из цитозольного фермента дигидрофолат-редуктазы, а также последовательности, образованные случайным образом из генома Е. coli, будучи присоединенными к белку-пассажиру, инициируют транспорт этого белка в митохондрию. Роль таких сигналов могут играть многие искусственные последовательности. Интересно отметить сходство между сигналом, ответственным за транспорт белка в митохондрию, и предполагаемой амфифильной спиралью, которая, по-видимому, образует «датчик напряжения» в ионных каналах. Очевидно, что для узнавания рецепторов, участвующих в импорте в митохондрию, существенны скорее некоторые особенности вторичной структуры, чем наличие характерных аминокислотных остатков. Как мы уже говорили, хорошую модель рецептора, способного связывать множество разнообразных пептидов, представляет антиген гистосовместимости HLA-A2.
Показано, что синтезированные химическим способом пептиды, соответствующие митохондриальным сигнальным последовательностям, связываются с липидными би- и монослоями и образуют спираль в присутствии некоторых фосфолипидов и детергентов. Кроме того, один из синтезированных пептидов блокирует импорт предшественников митохондриальных белков, возможно связываясь со специфическими рецепторами. Полагают, что сигнальная последовательность сначала вызывает концентрирование предшественника в мембранах, а затем связывание со специфическим рецептором в наружной мембране. Как видно из рис. 8, необходимым условием связывания является наличие трансмембранного потенциала на внутренней мембране. Исходя из предложенной модели амфнфильный сигнальный пептид сначала связывается с поверхностью мембраны, а затем продвигается внутрь ее под действием разности потенциалов. Такая промежуточная структура положительно заряженной спирали, погруженной в мембрану, конечно, нестабильна. Однако, если энергетический барьер перехода в это состояние меньше, чем примерно 18 ккал/моль, то пептид все же может пересекать мембрану с приемлемой скоростью. Впрочем, это маловероятно, особенно если учесть высокую плотность гидроксилированных аминокислот, обычно присутствующих в препоследовательностях помимо других положительно заряженных аминокислот. Согласно альтернативной модели, трансмембранный потенциал влияет на рецепторные белки или предполагаемый канал внутри мембраны, через который осуществляется перенос. Отметим, что для переноса в строму хлоропласта не требуется наличия трансмембранного потенциала, хотя сигналы, ответственные за транспорт белков в эти органеллы, сходны.
6. СИГНАЛЬНЫЕ ПЕПТИДАЗЫ
Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е. coli. Большинство экспортируемых белков Е. coli содержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы; ее структура представлена на рис. 10.12. Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. In vitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления. Сигнальная пептидаза, функционирующая в эидоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е. coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.
У Е. coli имеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е. coli замечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеи-новая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембра-носвязанного фермента протеазы IV.
В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте. Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.
7. РАСТВОРИМЫЕ И МЕМБРАНОСВЯЗАННЫЕ БЕЛКИ, НЕОБХОДИМЫЕ ДЛЯ ПЕРЕНОСА
Идентифицировано несколько цитозольных и мембраносвязан-ных белковых компонентов, необходимых для переноса. Наиболее детально охарактеризованы белковые факторы, участвующие во встраивании белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих.
1. Сигнал-распознающая частица. Это растворимый рн-бонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы 7S-PHK. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1 нМ. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полнпептидов, непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом; во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков in vivo. Одна из вероятных функций СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос. Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.
Некоторые небольшие белки транспортируются в эн-доплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромелиттин и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствие СРЧ и рибосом.
2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/ рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ и мембраносвязанным рецептором СРЧ, называемым также стыковочным белком. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с мол. массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране.
3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с мол. массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности. Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мем-браносвязанным рецептором, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего не известно; очистка его является довольно сложной задачей.
Было показано, что для переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей необходимы растворимые факторы, однако их сходство с СРЧ не установлено. Перенос различных секретируемых белков в дрожжах может происходить после завершения трансляции, поэтому не исключается, что в этих случаях образующиеся полипептидные цепи взаимодействуют с мембрано-связанным рецептором сигнальной последовательности. По-видимому, растворимые белковые факторы необходимы и для экспорта белков в Е. coli, а также для импорта белков в митохондрию, но охарактеризовать их не удалось. Было показано, что продукт гена secY, необходимый для экспорта белков в Е. coli, является мембраносвязанным, но его функция остается неизвестной.
Определенные успехи были достигнуты при идентификации рецептора на наружной митохондриальной мембране, необходимого для импорта белков. Опыты по связыванию с порином показали, что на мембране имеется некий рецептор с высоким сродством, который участвует в импорте ADP/ATP-переносчика, белка внутренней мембраны. Идентифицированы два разных полипептида -- компонента рецептора сигнальной последовательности наружной мембраны. При этом использовались два метода: блокирование импорта белков ан-тителами и химическое сшивание с синтетическим сигнальным пептидом. Интересно, что импорт в митохондрии, по-видимому, не связан с наружной мембраной, которая удаляется при образовании митопластов. Это наблюдение позволяет предполо-
жить, что другой рецептор сигнальной последовательности находится во внутренней мембране.
8. СБОРКА МУЛЬТИСУБЪЕДИНИЧНЫХ КОМПЛЕКСОВ И ОБНОВЛЕНИЕ МЕМБРАННЫЗ БЕЛКОВ
После встраивания мембранного полипептида в мембрану он еще должен приобрести правильную конформацию, обеспечивающую его биологическую активность, а если речь идет о мультнсубъ-единичных комплексах, то связаться с другими белками. В частности, у эукариот при этом должны произойти различные ковалент-ные модификации, например гликозилирование, ацилирование, сульфирование или образование днсульфидных связей. Даже когда такие модификации не являются необходимыми, процесс конформацион-ного созревания может быть медленным и отстоять по времени от встраивания в мембрану.
Например, у Е. coli четко наблюдается сборка стабильных три-меров обоих белков, LamB и OmpF, после включения соответствующих мономеров в наружную мембрану, при этом созревание LamB занимает около 5 мин. В эукариотнческих клетках гли-копротеин гемагглютннииа вируса гриппа, прежде чем попасть из эндоплазматического ретикулума в комплекс Гольджи, должен сформировать правильную четвертичную структуру, соответствующую зрелой форме. Несвериутые молекулы гемагглютинина остаются в эндоплазматическом ретикулуме. Образование тримеров занимает примерно 7--10 мии. Сходная олигомеризация наблюдается также для G-белка вируса везикулярного стоматита.
