Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование
спользование неспецифических эндонуклеаз. В сверхспиральные кольцевые молекулы могут быть внесены единичные разрывы с помощью неспецифических эндонуклеаз, например ДНКазы I. При этом образуется целый набор линейных молекул с разрывами в разных сайтах. После внесения разрыва и расширения делетированной области осуществляют лигирование с помощью методов, описанных ранее для устранения эндонуклеазных разрывов. При таком подходе используют некоторые интересные свойства ДНКазы I: в присутствии Мп2+ этот фермент расщепляет сразу обе цепи дуплексной ДНК, а в присутствии Mg2+ гидролизует за один раз только одну цепь, в результате чего в ДНК появляются одноцепочечные пробелы. Кроме того, фермент расщепляет сверхспиральную ДНК быстрее, чем линейную дуплексную, вследствие локальной неупорядоченности ДНК в сверхспиральном состоянии. Поэтому после непродолжительной обработки сверхспиральной ДНК ДНКазой I в присутствии Mg2+ образуются в основном полноразмерные линейные дуплексные молекулы. Обработка их с помощью Bal 31 или экзонуклеазы, а затем 81-нуклеазы расширяет образовавшийся ранее пробел. После лигирования отдельные продукты можно получить с помощью молекулярного клонирования.в. Инсерционные мутантыПринципы конструирования инсерционных мутантов сходны с описанными выше для делеционных мутантов. Клонированный сегмент ДНК расщепляют по одному из сайтов с помощью рестриктирующей эндонуклеазы или неспецифической эндонуклеазы. При необходимости заполняют пробелы на концах образовавшейся линейной молекулы или отщепляют одноцепочечные "хвосты" с помощью нуклеазы и осуществляют лигирование в присутствии сегмента, который хотят встроить в молекулу. В качестве вставки может использоваться синтетический фрагмент, содержащий множество сайтов для рестрикционных эндонуклеаз, - так называемый полилинкер. Если первое расщепление было неспецифичным, то появление новых сайтов рестрикции в наборе клонированных мутантов поможет построить физическую карту мутаций.г. Точечные мутацииХимический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработке сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в структуру дуплекса. При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ получения дуплексной молекулы с пробелом состоит в использовании векторной системы на основе фага М13. Для этого создают одноцепочечный М13-рекомбинант, содержащий нужный сегмент, а также другой, двухцепочечный, рекомбинант, содержащий такой же сегмент, но с делецией. Этот двухцепочечный рекомбинант денатурируют и реассоциируют с одноцепочечным, в результате чего образуется гетеродуплекс с пробелом.Если ДНК, содержащую одноцепочечный пробел, обработать бисульфитом натрия, то в одноцепочечном участке произойдет дезаминирование остатков цитозина с образованием урацила, т.е. дезаминируются только определенные остатки цитозина. Если пробел невелик, а число дезаминированных остатков цитозина ограничено благодаря малому времени реакции и низкой концентрации бисульфита, то возникает очень небольшое число специфических мутаций. Далее пробел заполняют с помощью ДНК-полимеразы и осуществляют лигирование. Вместо исходных С"С-пар в молекуле ДНК теперь содержатся пары и"А, которые после репликации превращаются в Т"А-пары.Мутагенное копирование. Специфические мутации другого типа можно получить, если при заполнении пробела вместо нормального дезоксирибонуклеозидтрифосфата использовать его мутагенный аналог. ДНК-полимераза I способна использовать в качестве субстратов различные аналоги обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Некоторые из них являются мутагенами. Например,] М6-гидро-ксидезоксицитидин-5'-трифосфат может включаться в синтезируемую цепь в положение, соответствующее А или G в матричной цепи в зависимости от того, находится ли он в иминной или аминной форме соответственно. Если пробел в дуплексной ДНК заполняется с помощью HO-dCTP вместо dTTP, то напротив А будет находиться HO-dC. После трансфекции и репликации наряду с нормальными формами будут обнаруживаться мутантные геномы с транзициями Т * А - " С * G. Проведя отбор, эти мутанты можно клонировать. Аналогично замещение dCTP на HO-dCTP приводит к транзициям С * G - > Т * А.Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олигодезоксинуклеотиды можно синтезировать в больших количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специфических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа. Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают синтетический олигодезоксирибонуклеотид длиной от 8 до 20 нуклеотидов, содержащий мутантную последовательность. Этот олигодезоксирибонуклеотид выполняет роль праймера, а оставшийся одноцепочечным участок-роль матрицы при синтезе ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы I. После копирования всей кольцевой молекулы начало и конец новой цепи соединяют лигазой. Образовавшаяся дуплексная молекула содержит неспаренные основания в мутантной последовательности. Интересно, что фаговое потомство, вышедшее из одной инфицированной клетки, сегрегирует как смешанная популяция фагов дикого типа и мутантных рекомбинантов, которые можно разделить при последующем клонировании.При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.Изучение функций клонированных сегментов ДНКНередко клонирование определенных сегментов геномной ДНК, или кДНК, осуществляют с целью выяснения функций их внутриклеточных двойников.Исходя из результатов структурного анализа клонированных последовательностей, указывающих на присутствие в них открытых рамок считывания, можно предположить, что они содержат гены. Часто удается выявить специфические промоторные последовательности и другие регуляторные элементы. Однако, чтобы подтвердить эти данные, необходимо провести прямые функциональные исследования. При этом нужно ответить на следующие вопросы:1. Транскрибируется ли данная последовательность только в одном или нескольких типах клеток? 2. Являются ли транскриптами молекулы мРНК? 3. Влияют ли на транскрипцию изменения, происходящие в клетке? 4. Содержит ли клонированный сегмент промоторы, терминаторы или другие регуляторные сигналы, и если да, то как они работают? 5. Какова связь между структурой клонированного сегмента и структурой внутриклеточных транскриптов? 6. Могут ли транскрипты транслироваться в полипептид? Для ответа на все эти вопросы используют различные экспериментальные подходы в зависимости от того, какая именно система анализируется.а. Характеристика внутриклеточных транскриптов, соответствующих клонированным сегментам ДНКГоворя о любом клонированном сегменте генома, нам прежде всего необходимо ответить на вопросы, связанные с его транскрипцией in vivo. Очень важными являются также данные о структурном сходстве между клонированной кДНК и внутриклеточными родственными транскриптами. В основе соответствующих исследований лежат три метода: РНК-блоттинг, анализ с использованием специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз и копирование РНК, выделенной из клеток, с помощью обратной транскриптазы. Все методы включают предварительное выделение и очистку РНК из целых клеток или специфических внутриклеточных органелл, таких, как ядро или цитоплазма. Результативность всех методов зависит от способности РНК образовывать гетеродуплексы с комплементарной клонированной ДНК.РНК-блоттинг. Блоттинг РНК аналогичен блоттингу ДНК. Он состоит в следующем. Выделенную РНК разделяют по размерам с помощью электрофореза в агарозном геле. Обычно электрофорез проводят в условиях, способствующих денатурации РНК, чтобы свести к минимуму влияние вторичной структуры молекулы на ее электрофоретическую подвижность. Щелочные условия для этой цели не подходят ввиду лабильности фосфодиэфирных связей в молекуле РНК в этих условиях. Поэтому используют такие агенты, как глиоксаль, формальдегид или мочевину. Затем РНК переносят на иммобилизованную подложку, стараясь сохранить распределение молекул РНК. Далее используют меченую ДНК в качестве зонда для выявления на фильтре соответствующих молекул РНК. Фильтр инкубируют с ДНК в условиях, благоприятствующих гибридизации. Промыв фильтр для удаления избыточной ДНК, с помощью радиоавтографии устанавливают положение зонда, а следовательно, и положение гомологичной РНК в том геле, в котором проводился электрофорез. Таким способом выявляют продукты транскрипции клонированного сегмента ДНК. Если на параллельной дорожке этого же геля одновременно провести разделение смеси РНК или молекул одноцепочечной ДНК известного размера, то можно оценить размер транскриптов. Кроме того, РНК-блоттинг позволяет оценить количество РНК, синтезированной в клетках, из которых она получена. Метод оценки аналогичен используемому при определении числа копий ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах. Плотность полосы на рентгеновской пленке пропорциональна количеству присутствующей гомологичной РНК. Как и ранее, желательно, чтобы меченый зонд был одноцепочечным, поскольку он не должен реассоциировать с комплементарной цепью ДНК вместо РНК.С помощью всех этих довольно простых методов можно получить обширную информацию о функциональных свойствах клонированного сегмента ДНК. Сюда относятся не только данные о способности к транскрибированию, но и оценка числа траскриптов и ее зависимость от типа клеток или внеклеточной среды. Анализируя РНК из очищенных клеточных компонентов, можно установить, где локализуются разные транскрипты - в ядре, цитоплазме или полисомах. Часто очень важным является вопрос о полиаденилировании гомологичной РНК, поскольку полиаденилирование является характерным признаком большинства эукариотических мРНК. Разделить полиаденилированную и неполиаденилированную] РНК не составляет труда, поскольку полиаденили-рованная РНК спаривается при соответствующих условиях с poly или poly. Сами полимеры обычно фиксируют на инертной твердой подложке, что упрощает отделение несвязанной poly-PHK. Фракцию poly-PHK элюируют при денатурирующих условиях. Затем РНК из каждой фракции подвергают электрофорезу, блоттингу итестированию на способность гибридизоваться с клонированной ДНК. Если РНК, идентифицированная с помощью клонированной ДНК, выделена из цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего она представляет собой мРНК. Идентификация становится более надежной, если, кроме того, РНК связана с полисомами.Еще одной характеристикой мРНК, гибридизовавшихся с клонированным сегментом ДНК, является их размер. Иногда РНК имеет больший размер, чем клонированный сегмент; это означает, что в клоне представлена лишь часть гена. В других случаях РНК оказывается короче клонированного сегмента, что свидетельствует о наличии в клонированной последовательности дополнительных последовательностей, не представленных в транскрипте. Это могут быть геномные последовательности, фланкирующие транскрибируемую область, или не-кодирующие последовательности, прерывающие кодирующую область и подвергающиеся сплайсингу во время созревания мРНК. Все эти взаимоотношения между клонированным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК можно установить более точно, используя специфичные к одноцепочечным ДНК нуклеазы или осуществляя обратную транскрипцию.Исследование родства между клонированным сегментом ДНК и внутриклеточной РНК с помощью ДНК-РНК-гибридизации и специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз. Эксперимент включает три этапа. На первом клонированный фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом и денатурируют. Можно также использовать одноцепочечную ДНК. На втором этапе ДНК гибридизуют с выделенной клеточной РНК в растворе в условиях, благоприятных для образования ДНК-РНК-гибридов. Любые последовательности ДНК, присутствующие в клонированном фрагменте, но не представленные в РНК, остаются одноцепочечными. Их удаляют с помощью нуклеазы, специфичной к одноцепочечной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денатурируют и подвергают гель-электрофорезу. Размер образующейся радиоактивной ДНК определяют с помощью радиавтографии, сравнивая положение исследуемой ДНК с положением молекул ДНК известного размера.Этот основной эксперимент можно проводить во многих разных вариантах, каждый из которых позволяет выявить свои особенности структуры РНК в зависимости от того, какая именно нуклеаза используется, является ли РНК суммарной или очищенной цитоплазматической ро1у-мРНК. Один из таких вариантов, где в ДНК имеется один протяженный участок, комплементарный РНК, и не спарены только концы молекулы. Метод позволяет также выявить любую область, где отсутствует комплементарность между РНК и ДНК. Во многих экспериментах такого рода используется специфичная к одноцепочечной ДНК эндонуклеаза S1, поэтому метод называют картированием.81-картирование часто используют для установления соответствия между началом молекулы РНК и специфическим сайтом в клонированном сегменте ДНК. Во многих случаях этот сайт представляет собой сайт инициации транскрипции. Точность эксперимента значительно повышается, если используется небольшой ДНК-зонд, что позволяет измерить длину защищенного сегмента ДНК с точностью до одного нуклеотида. Для получения такого зонда обычно субклонируют строго определенные участки длинного фрагмента ДНК. Размер защищенного фрагмента ДНК определяют с помощью электрофореза в таких же гелях, что и при определении нуклеотидной последовательности.Удлинение праймера: исследование родства между внутриклеточной РНК и клонированным фрагментом ДНК с помощью обратной транскриптазы. Для проведения этого эксперимента необходим относительно короткий ДНК-зонд, который гибридизуется с участком РНК, желательно находящимся на расстоянии не более 100 пар оснований от предполагаемого 5'-конца РНК. ДНК-зонд отжигают с РНК, и он играет роль праймера при обратной транскрипции, а матрицей служит РНК. Поскольку обратная транскриптаза прекращает копирование, когда достигает 5'-конца РНК, размер продукта позволяет установить, где начинается РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно меченным, что позволяет легко определить положение продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен только к конкретной РНК, исследуемый препарат может представлять собой смесь разных РНК.б. Функциональное тестирование клонированной ДНККлонированные сегменты ДНК можно транскрибировать и транслировать в эукариотических системах либо in vitro с использованием клеточных экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo после введения клонированного сегмента в клетку.Системы in vitro. Для приготовления бесклеточных экстрактов, содержащих РНК-полимеразы I, II и III, обычно используют разнообразные эукариотические клетки. В анализируемом сегменте должны присутствовать последовательности, ответственные за регуляцию транскрипции; необходимы также вспомогательные белки, стимулирующие транскрипцию. При фракционировании таких экстрактов получают очищенные или частично очищенные полимеразы и факторы, с помощью которых можно детально изучить механизмы транскрипции. Для осуществления трансляции мРНК с образованием соответствующих полипептидов используют другие типы клеточных экстрактов.Системы in vivo. Для изучения функций клонированного сегмента ДНК лучше всего использовать целые клетки, поскольку это позволяет следить как за процессом транскрипции, так и за процессом трансляции. Наиболее изученной биологической тест-системой являются ооциты лягушки. Ооциты - это крупные клетки объемом до 1 мкл, которые можно многократно получать от одной лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро, при этом обычно достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплексе с гистонами ооцита упаковывается с образованием хроматина, далее осуществляются ее транскрипция и трансляция, и в течение нескольких часов можно идентифицировать продукты экспрессии генов - мРНК и полипептиды. Для проведения эксперимента часто оказывается достаточно того количества РНК и полипептидов, которое синтезируется одним ооцитом. Во многих отношениях экспрессия инъецированных клонированных генов в ооцитах протекает нормально. Исходные ядерные транскрипты генов РНК-полимераз II и III подвергаются процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят в цитоплазму.Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в эукариотические клетки в культуре. Молекулы можно инъецировать непосредственно в отдельные клетки, однако проще вводить клонированные молекулы в большую популяцию клеток одновременно. При этом используется методика трансфекции в связи с клонированием в эукариотических клетках. По крайней мере часть молекул, введенных таким способом, достигает ядер.Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНКВ предыдущих разделах мы уже не раз останавливались на синтезе in vitro и in vivo полипептидов, кодируемых вставками в рекомбинантных векторах. Скрининг по фенотипу зависит от экспрессии интересующего нас гена в клетках хозяина. Отбор нужных клонов такими методами, как HART и гибридизационная селекция, осуществляется с помощью трансляции in vitro, а функциональный анализ клонированного сегмента после введения его в исходную клетку основывается на изучении как транскрипции, так и трансляции. Цель многих экспериментов по клонированию состоит в синтезе нужного полипептида, а иногда - в получении его в количествах, достаточных для проведения фенотипического анализа. В ряде случаев цель клонирования состоит в получении антител. В этом разделе мы опишем некоторые системы хозяин-вектор, специально созданные для продукции нужного белка.
