Ангиотензинпревращающий фермент (АПФ, дипептидил-карбоксипептидаза A, кининаза II, карбоксикатепсин, пептидилдипептидаза А, КФ 3.4.15.1) обладает пептидилдипептидазной и слабыми трипептидилкарбоксипептидазной и эндопептидазной активностями [50]. Он выделен и очищен из разных тканей, в том числе из мозга, различных видов животных[46]. Фермент из всех тканей (эндотелиальная форма), за исключением семенников (тестикулярная форма), имеет очень близкие физико-химические и иммунологические свойства, тогда как фермент из семенников отличается от ангиотензинпревращающего фермента из других источников по молекулярной массе и иммунологическим свойствам.
В мозге обнаружена только эндотелиальная форма. Она состоит из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу 170-180 кДа и содержит около 13% остатков нейтральных сахаров. Эндотелиальная форма состоит из двух гомологичных доменов, каждый из которых имеет активный центр и центр связывания Zn2+ [10].
Отличия в степени гликозилирования приводят к образованию двух иммунологически идентичных форм, одна из которых (эндотелиальная) с молекулярной массой 180 кДа присутствует, исключая семенники, во всех тканях, в том числе и мозге, а вторая (нейрональная) с молекулярной массой 170 кДа - обнаруживается только в мозге, и не присутствует в других тканях.[41]
Имеются единичные сообщения об обнаружении в различных органах и тканях более высокомолекулярных каталитически активных форм АПФ с молекулярной массой 600 кДа, 430 кДа, 330 кДа, 240 кДа, иммунологически полностью идентичных эндотелиальной форме. В настоящее время неясно, являются ли эти формы предшественниками АПФ, или образуются при гель-фильтрации благодаря склонности молекул фермента, как и других мембраносвязанных белков, к агрегации. pI фермента из различных органов и тканей колеблется в пределах от 4,6 до 5,1, что обусловливает дополнительную гетерогенность фермента при электрофоретическом разделении. Полагают, что гетерогенность АПФ может иметь важное значение для избирательности регуляции его активности в различных тканях. [25].
АПФ из различных источников имеет оптимум pH 7,6-8,2, для проявления максимальной активности необходимы ионы Cl- .[30] АПФ содержит 1 прочно связанный ион Zn2+ на каждый активный центр и сильно ингибируется хелатирующими агентами, такими как ЭДТА и о-фенантролином [61]. Фермент ингибируется брадикининпотенциирующим фактором (Ki 40 нМ), дитиотреитолом, 2-меркаптоэтанолом и додецилсульфатом натрия. N-этилмалеимид, бацитрацин, пуромицин, фосфорамидон, тиорфан, ингибитор металл-зависимых основных карбоксипептидаз ГЭМЯК не влияют на его активность [10]. Создан целый класс пептидных аналогов субстратов АПФ с Ki порядка 10-50 нМ, наиболее известные из них каптоприл (IC50 20 нМ), еналаприл (IC50 25-35 нМ), лизиноприл (IC50 3-10 нМ) [49].
Фермент in vitro катализирует расщепление в общей сложности более 30 биологически активных пептидов и их предшественников [75]. Он превращает ангиотензин I в ангиотензин II (Km 4-70 мкМ), последовательно отщепляет два дипептида с C-конца брадикинина, расщепляет неокиоторфин с образованием киоторфина (Km 0,58 мМ), Met-энкефалин-Arg6-Phe7 с образованием Met-энкефалина (Km 0,30 мМ), вещество P и вещество K, холецистокинин и гастрин, энкефалин, нейротензин, нейрокинины A и B, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона. АПФ катализирует образование Met-энкефалин-Arg6 из Met-энкефалин-Arg6-Gly7-Leu8, отщепляет последовательно два дипептида с C-конца динорфина A 1-8, расщепляет натрийуретический фактор из мозга и предсердий, вазопрессин, окситоцин.
Активность АПФ in vitro ингибируется многими биологически активными пептидами и их предшественниками: неокиоторфином, Met-энкефалин-Arg6-Phe7, -липотропином, веществом P, брадикинином, Leu-энкефалин-Arg6 и некоторыми дипептидами [10].
АПФ широко распространён в тканях человека и животных. Наиболее высокий уровень АПФ в периферических тканях обнаружен в лёгких и семенниках, в почках активность АПФ примерно в 25 раз меньше, чем в лёгких. В сыворотке крови активность АПФ примерно в 200 раз ниже, чем в лёгких [18]. Активность фермента в мозге сопоставима с активностью в почках. Наиболее высокое содержание АПФ обнаружено в гипофизе и стриатонигральном тракте. АПФ локализован преимущественно в синаптосомах [43]. В стриатонигральном тракте фермент связан с фракцией мембран, содержащей мускариновые рецепторы, причём в этой фракции обнаруживается только нейрональная, но не эндотелиальная форма АПФ. Таким образом, на мембранах дендритов локализована только нейрональная форма АПФ.[41]
Хорошо известно, что АПФ является компонентом ренин-ангиотензиновой системы. В периферических органах и тканях он вовлекается в обмен ангиотензина и брадикинина и является важным звеном регуляции артериального давления, водно-солевого баланса и воспалительных процессов.[60] В последнее время обнаружено, что АПФ вовлекается в определение эмоционального статуса животных, устойчивости к эмоциональному стрессу [12], агрессивности [16], предрасположенности к потреблению этанола, мозговой АПФ вовлекается в формирование наследственно обусловленной гипертонии, в ответ на воздействие стрессирующих факторов [27] и потребление этанола [17]. Ингибиторы АПФ влияют на потребление воды и этанола, усиливают анальгетическую активность Met-энкефалин-Arg6-Leu7 и подавляют его деградацию в мозге. Каптоприл, кроме того, обладает центральным действием, является антидепрессантом, его антидепрессивный эффект блокируется налоксоном, он пролонгирует и усиливает анальгетические эффекты Met- и Leu-энкефалинов, причём это усиление также блокируется налоксоном. Участие АПФ в некоторых из перечисленных выше физиологических и патологических процессов, а также многие из перечисленных эффектов, вызванных введением его ингибиторов, невозможно объяснить исходя из представления, что единственной функцией АПФ является участие в обмене ангиотензинов и брадикинина. Приведенные факты позволяют предположить, что АПФ вовлекается в обмен и других регуляторных пептидов [10], что подтверждается и достаточно высокой активностью фермента в мозге.
1.2.3 ЛейцинаминопептидазаЛейцинаминопептидаза (КФ 3.4.11.1) проявляет широкую субстратную специфичность и отщепляет практически любые N-концевые аминокислоты, за исключением аланина и цистеина [56]. Она гидролизует амид лейцина лучше, чем ариламид лейцина, с меньшей скоростью расщепляет лизин- и аргининамид. Фермент имеет по данным Хрусталёвой [36] и Fraticante и соавт. [51] молекулярную массу около 62 кДа, по данным Shimamura и соавт. [74] - 53000, по данным Gibson и соавт [56] - 270 кДа, что позволяет предположить возможность существования субъединичной структуры. Он проявляет максимальную активность при нейтральных и слабощелочных значениях pH, активируется ионами Mn2+, ингибируется ПХМФС, бестатином и амастатином; пуромицин и арфаменин A не влияют на его активность [72]. Фермент отщепляет остаток тирозина от Tyr-Gly-Gly, Tyr-Gly-Gly-Phe, Leu-энкефалина, динорфина-(1-8), динорфина-(1-10) и динорфина-(1-13), максимальная скорость расщепления наблюдается в случае Leu-энкефалина, с удлинением цепи скорость расщепления субстрата резко уменьшается [56]. Активность фермента равномерно рапределена между серым и белым веществом коры полушарий. Он обнаружен как в цитозольной так и мембранной фракциях головного мозга, особенно высокая активность найдена в миелине. Считают, что лейцинаминопептидазе принадлежит важная роль в инактивации энкефалинов, вещества Р и, возможно, большинства других регуляторных пептидов [36].
1.3 Механизм адаптации к физической работе. Роль регуляторных пептидовОдним из эндогенных пептидов, широко представленных в разных отделах мозга, в том числе и в эмоциогенных зонах гипоталамуса, является вещество Р. Известно, что вещество Р способно оказывать непосредственное влияние на активность центральных нейронов, в большинстве случаев возбуждая их. Вместе с тем была отмечена способность вещества Р изменять реакции нейронов на нейромедиаторы. Доказано, что вещество Р способно снижать степень выраженности невротических состояний, нормализовать сон, улучшать память и процессы обучения, что позволяет рассматривать его как модулятор физиологических и патологических процессов.
Кроме того, вещество Р, содержащееся в нейронах задних рогов спинного мозга, способно передавать сигналы от периферических болевых рецепторов в центральные отделы нервной системы. Исследования на крысах позволили рассматривать вещество Р, синтезирующееся в гипоталамусе, как один из возможных пептидных факторов устойчивости к эмоциональному стрессу[37]. Вещество Р оказывает также модулярное влияние на метаболизм катехоламинов мозга при эмоциональном стрессе, выражающееся в способности вызвать долговременные изменения содержания норадреналина и дофамина в гипоталамусе и среднем мозге в сторону повышения, что расценивается как проявление центральных нейрохимических механизмов адаптации к эмоциональному стрессу[37].
Экспериментальные данные показывают, что содержание вещества Р в гипоталамусе коррелирует с устойчивостью к эмоциональному стрессу [48]. У больных неврозом отмечены снижение содержания вещества Р в крови и расстройства сна. У экспериментальных животных, подвергнутых эмоциональному стрессу, также нарушается электроэнцефалографическая структура сна. Сон является антистрессовым фактором. Во время бодрствования содержание вещества Р в крови снижается. При полноценном сне его уровень вновь повышается. Введение в организм животных, подвергнутых эмоциональному стрессу, вещества Р восстанавливает нормальную структуру сна. Таким образом, эмоциональный стресс, нарушая сон, лишает организм одного из защитных механизмов, с помощью которого повышается содержание вещества Р и обеспечивается устойчивость к стрессу. Учитывая то, что организм способен сам синтезировать вещество Р в большей степени во время сна, с одной стороны, и то, что содержание этого вещества в гипоталамусе коррелирует с устойчивостью к эмоциональному стрессу, с другой стороны, встает вопрос: каким путем, кроме полноценного сна, можно добиться ускоренного и полного восстановления в организме уровня вещества Р.
Одним из путей достижения этой цели, на наш взгляд, является использование рефлексотерапевтических методов (игло-, электро- и прессотерапии). Воздействуя на определенные биологически активные точки организма, связанные с гипоталамусом и средним мозгом, можно "запустить" выработку данными структурами мозга вещества Р. Физиологический эффект вещества Р как одного из эндогенных пептидов проявляется в модуляторном действии, выражающемся в способности влиять на нейрохимические свойства и катехо-ламиновый метаболизм нейронов, участвующих в формировании эмоциональных реакций, и тем самым прекращать нейромедиаторную интеграцию отрицательного эмоционального возбуждения, от которой зависит продолжительность отрицательной эмоциональной реакции, а значит и возможность развития эмоционального стресса.
В работах М.А. Звягинцевой (1988) [23], К.В. Судакова (1989) [32] разрабатываются способы коррекции и купирования стрессовых реакций и вызванных ими нарушений кровообращения с помощью эндогенных нейропептидов, а именно субстанции Р и пептида дельта-сна. Как показали исследования, субстанция Р обладает антистрессовым действием, улучшает функциональные состояния головного мозга и нормализует АД. Синтез в мозге эндогенных пептидов (вещества Р и, возможно, других эндогенных пептидов) может быть одним из факторов, определяющих генетические и индивидуальные различия в устойчивости к острому и хроническому эмоциональному стрессу и особенность метаболизма биогенных аминов в различных структурах мозга у устойчивых и предрасположенных к эмоциональному стрессу особей. Другими эндогенными пептидами, регулирующими эмоциональные реакции, в том числе и стрессовые, помимо вещества Р, являются эндорфины и энкефалины. Они так же, как и вещество Р, широко представлены в различных отделах мозга, в том числе в эмоциогенных зонах лимбической системы и в промежуточной доле гипофиза[4].
Эндорфины и энкефалины обладают необычайной способностью подобно морфину и героину снимать болевые ощущения. Это так называемые естественные опиаты. Тот факт, что морфин, героин и эндорфины связываются в одних и тех же местах, позволяет предположить, что эндорфины играют роль и в тех разновидностях эмоций, которые не имеют прямого отношения к боли. Ф. Блум и соавт. (1988) [4] показали, что у экспериментальных животных и человека при стрессе происходит выработка и высвобождение эндорфинов в нервных сетях. Высвободившиеся эндорфины, по всей вероятности, действуют двояко. С одной стороны, как опиаты, с другой - как регуляторы эмоциональных (стрессовых) реакций. Как опиаты, они блокируют высвобождение в синапсах задних рогов спинного мозга вещества Р, выделяемого из медленных (безмиелиновых) волокон, проводящих болевые импульсы от болевых рецепторов. В результате этого постсинаптический нейрон подвергается более слабой стимуляции веществом Р и головной мозг получает меньше болевых импульсов. Как регуляторы эмоциональных реакций, они каким-то образом, по всей вероятности через лимбическую систему, регулируют возбуждение, страх и другие стрессовые состояния в соответствии с ситуацией [35].
В настоящее время протеолиз рассматривается не только как процесс катаболической утилизации биологически активных пептидов, но и как регуляторный фактор, функция которого состоит в запуске и прерывании ряда биохимических и физиологических процессов при различных функциональных состояниях организма. Практически неизученным остается вопрос об изменениях в функции ферментов обмена нейропептидов при физической работе, в то время как именно активность этих ферментов определяет уровень биологически активных пептидов в организме и, следовательно, степень адаптации организма к физической работе. Физическую работу можно отнести к факторам стресса.
Обнаружено, что у устойчивых к стрессу животных в гипоталамусе и стриатуме активность КПN при воздействии стресса повышается. Авторами высказано предположение, что такой эффект наблюдается в связи с активацией синтеза в исследованных отделах нейропептидов (энкефалинов, вещества Р и др.), играющих ключевую роль при адаптации к стрессу [38].
Особый интерес представляют исследования, касающиеся влияния различных веществ на ферменты обмена нейропептидов при стрессе. Известно, что этанол ослабляет некоторые физиологические проявления стресса, усиливает секрецию стресс-пептидов, а так же активирует энкефалинэргическую систему. Поскольку уровень опиоидных и стресс-пептидов в организме контролируется КПN, то представляется возможным, что КПN определяет характер влияния этанола на организм при стрессе. Характер влияния этанола на физиологические проявления стресса связан с особенностями стрессирующего фактора. Сведения о гиперактивации КПN при совместном действии этанола иммобилизационного или хронического ЭБС в отделах мозга, где синтезируются опиоидные пептиды, вещество Р, подтверждают данные об адаптогенном действии этанола при стрессе. Однако такая активация пептидэргических систем ведет к тяжелым последствиям для организма, так как вызывает более быстрое истощение этих систем.
АПФ участвует в деградации энкефалинов, вещества Р и ПВДС - биологически активных пептидов, основная роль которых заключается в адаптации организма к стрессу [8].
Таким образом, изменения в проявлении функциональной активности ферментов процессинга и инактивации биологически активных пептидов при стрессе свидетельствуют о важной роли этих ферментов в регуляции уровня активных нейропептидов, участвующих, как в развитии, так и в торможении размаха стресс-реакции.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1 Материалы исследованияВ исследовании использовали сыворотку крови, полученную путем центрифугирования крови при 4000 об/мин в течении 30 мин. Забор крови осуществлялся из локтевой вены у спортсменов квалификации мастер спорта и мастер спорта международного класса, вид спорта: легкая атлетика, средний бег и триатлон (n=12). В качестве контрольного материала использовали сыворотку крови студентов и аспирантов ВУЗов города Пензы (n=12).
2.2 Методы исследования2.2.1 Моделирование физической работыКаждая группа делилась на две подгруппы - до нагрузки и на субмаксимальной нагрузке. Физическую работу создавали с помощью программируемого тредбана Tunturi 90, начиная со скорости 3,5 м/с, повышая каждые две минуты на 0,5 м/с до скорости, характеризующейся подъемом пульса до 180 ударов в минуту, на которой испытуемый бежал до состояния полного утомления. Пробы крови отбирались из локтевой вены до нагрузки и непосредственно после остановки тредбана.
2.2.2 Метод определения концентрации вещества PКонцентрацию вещества Р определяли иммуноферментным методом ELISA [42] в сыворотке крови. Для получения сыворотки кровь центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. 2.2.3 Метод определения активности КПNСыворотку крови (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ СоSO4 в 100 мМ трис-НСl буфере, рН=7,6,и преинкубировали 8 мин при 37°С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл кбз-Gly-Arg в вышеуказанном буфере. Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося Arg нингидриновым методом (добавляли 1 мл нингидрина). Далее инкубация 12 мин на кипящей водяной бане. Затем пробы колориметрировали на КФК-2 при л=590 нм. Активность КПN определяли по отщеплению Arg от кбз-Gly-Arg как Со?+- активируемую. Активность фермента выражали в нмоль Arg, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли по методу Лоури.2.2.4 Метод определения активности ангиотензинпревращающего ферментаАктивность ангиотензинпревращающего фермента определяли по образованию Gly-Arg из кбз-Gly-Gly-Arg при рН=8,2, как активность, ингибируемую каптоприлом. Сыворотку крови (40 мкл) смешивали с 20 мкл 35 мкМ каптоприла в 100 мМ трис-НСI буфере,рН=8,2, или 20 мкл буфера и преинкубировали 8 мин при 37°С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора кбз-Gly-Gly-Arg в вышеуказанном буфере. Через 120 мин реакцию останавливали прибавлением 30 мкл 10% трихлоруксусной кислоты. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося Gly-Arg нингидриновым методом (добавляли 1 мл нингидрина). Далее инкубация 12 мин на кипящей водяной бане. Пробы колориметрировали на КФК-2 при л=590 нм. Активность ангиотензинпревращающего фермента определяли как разность в оптической плотности проб не содержащих и содержащих каптоприл. Активность фермента выражали в нмоль Gly-Arg, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли по методу Лоури.2.2.5 Метод определения активности лейцинаминопептидазыДля определения активности лейцинаминопептидазы 90 мкл сыворотки крови смешивали с 10 мкл раствора пуромицина, приготовленного на соответствующем буфере (в случае опытной пробы (I)) и к 10 мкл 20 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) (в случае опытной пробы (II) и контрольной пробы). Далее проводили преинкубацию 8 мин при 37?С. Реакцию начинали прибавлением в опытные пробы 100 мкл 310 мкМ раствора лей--нафтиламина, приготовленного на буфере. Через 30 мин реакцию останавливали прибавлением 40 мкл 10% раствора ТХУ. В контрольные пробы добавляли 100 мкл субстрата. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. Отбирали 100 мкл надосадочной жидкости, добавляли по 1,5 мл натрий-ацетатного буфера (рН 4,2). Измерение флюоресценции образовавшегося -нафтиламина проводили на флюориметре ФМЦ-2 при лex=360 нм и лem=420 нм в кювете толщиной 1 см. Активность фермента определяли как разность между опытной пробой (I) и контрольной пробой и выражали в мкмоль -нафтиламина, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Белок определяли методом Лоури.
