2.1.1. б,в-адренолитики: лабеталол.
2.1.2. б-адренолитики: фентоламин, пирроксан, дигидроэрготамин, дигидроэрготоксин: б1 и б2, празозин (только б1).
2.1.3. в-блокаторы: пропранолол, окспреналол, пиндолол - в1 и в2, талинолол - кардиоселективные в1, метопролол и атенолол - в1.
2.2. Адренолитики непрямого действия (симпатолитики): резерпин, октадин, ормид, метил-ДОФА.
б1,2-адреноблокаторы представляют собой дигидрированные алкалоиды спорыньи. Сюда относят фентоламин, пирроксан, дигидроэрготамин, дигидроэрготоксин.
Данные лекарственные средства применяют: а) для лечения расстройств переферического кровообращения; б) лечение трофических язв, ран, отморожений; в) купирование гипертонических кризов (фентоламин внутривенно); г) диагностика и лечение феохромоцитом (опухоль мозгового слоя надпочечников, адреналин выходит в кровь и состояние подобно гипертоническим кризам); д) лечение мигреней (сильная головная боль с рвотой, связанная с повышением амплитуды пульсации сосудов головного мозга; е) для лечения артериальной гипертензии используются вещества, которые избирательно блокируют постсинаптические альфа1-адренорецепторы (они снимают влияние симпатических нервов на сосуды и сосуды расширяются).
Механизм антидепрессивного действия этих препаратов неясен. Вначале было предположено, что оно обусловлено периферическим адренонегативным эффектом, в результате которого по механизмам обратной связи повышается содержание норадреналина в мозге [Бару А. М., 1970; Нуллер Ю. Л., 1970]. За последние годы появились данные о влиянии антидепрессантов на чувствительность норадренергических рецепторов. Так, антидепрессивное действие миансерина частично связывают с торможением а2-адренорецепторов.
1.3. Адренергическая и пептидергическая системы
Адреналин был впервые обнаружен в экстрактах надпочечников в 1895г. В 1901г, был осуществлен синтез кристаллического адреналина. Вскоре адреналин нашел применение в медицине для повышения артериального давления при коллапсе, для сужения кровеносных сосудов при местной анестезии, а затем и для купирования приступов бронхиальной астмы. В 1905г. было обнаружено важное физиологическое значение адреналина. Исходя из сходства действия адреналина с эффектами, наблюдающимися при раздражении симпатических нервных волокон, было высказано предположение, что передача нервного возбуждения с симпатических нервных окончаний на эффекторные клетки осуществляется при участии химического передатчика (медиатора), которым является адреналин или адренолиноподобные вещества. Этим было положено начало учению о химической передаче нервного возбуждения. В дальнейшем был раскрыт процесс биосинтеза адреналина, начиная от аминокислоты тирозина, через диоксифенилаланин (L-дофа), дофамин, норадреналин до адреналина. В 1946г. было устанавлено, что основным медиатором адренергической (симпатической) передачи является не сам адреналин, а норадреналин. Образующийся в организме эндогенный адреналин частично участвует в процессах проведения нервного возбуждения, но главным образом играет роль гормонального вещества, влияющего на метаболические процессы. Норадреналин осуществляет медиаторную функцию в периферических нервных окончаниях и в синапсах ЦНС. Биохимические системы тканей, взаимодействующие с норадреналином, называют адренореактивными (адренергическими) системами, или адренорецепторами ("Адреноцепторы"). По современным представлениям, норадреналин, выделяющийся в процессе нервного импульса из пресинаптических нервных окончаний, воздействует на норадреналино-чувствительную аденилатциклазу клеточной мембраны адренорецепторной системы, что приводит к усиленню образования внутриклеточного 3'-5'-циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), играющего роль "вторичного" передатчика (медиатора), к активации биосинтеза макроэргических соединений и далее к осуществлению адренер- гических физиологических эффектов. Важную роль в передаче импульсов в ЦНС играет также дофамин, являющийся химическим предшественником норадреналина, но выполняющий самостоятельную нейромедиаторную роль.
Образование медиатора предполагается по следующей схеме: фенилаланин -> тирозин -> диоксифенилаланин (ДОФА) -> дофамин (1-й медиатор, катехоламин) -> норадреналин (главная роль в передаче возбуждения в адренэргических синапсах). Норадреналин в синапсах и надпочечниках может переходить в адреналин и наоборот).
Начиная с третьей реакции происходят в нервных клеток (первые реакции - в печени). Медиаторы спускаются по аксону в везикулах в пресимпатические окончания. В процесс транспота везикул принимают участие ионы магния. Медиаторы могут разрушаться МАО тип А (разрушает норадреналин, адренолин и серотонин). Норадреналин и адреналин для защиты от МАО соединяются со специальными белками и АТФ (образуется депо). Это - стабильные гранулы (стабильная фракция). Лабильная фракция представлена несвязанным медиатором в везикулах. Кроме того имеется небольшое количество свободного адреналина в цитоплазме, но он легко разрушается ферментами.
После выхода медиатора в синаптическую щель его излишки могут разрушаться КОМТ. Может также осуществляться обратный захват части медиатора пресинаптической мембраной.
Влияние адреналина на артериальное давление предполагает несколько фаз: в первую фазу происходит активация в1-адренорецепторов миокарда, что ведет к увеличению сердечного выброса; во второю - задержка подъема давления (вагодепрессорный рефлекторный эффект); третья фаза сопровождается влиянием адреналина на б (подъем) и в (спад) рецепторы сосудов и четвертая - следовая гипотензия, быстрый нейрональный захват адреналина, инактивация его избытка ферментом КОМТ.
В регуляции функций организма, наряду с классическими медиаторами, важная роль принадлежит регуляторным факторам пептидной природы. Регуляторные пептиды широко распространены в различных тканях, в том числе и в нервной. Они принимают участие в нейрохимических механизмах, поддерживающих основные гомеостатические константы организма, формирующих и осуществляющих целенаправленное поведение, а также в процессах, контролирующих эмоциональную сферу, мотивацию, память [3]. Вероятно, именно биологически активным пептидам принадлежит важная роль в интеграции функциональных систем организма, обеспечении их слаженной работы в изменяющихся условиях окружающей среды. Они играют ключевую роль в регуляции иммунологической защиты, в запуске адаптивных защитных реакций при инфекции, повреждении тканей, стрессе, а также в формировании патологических состояний организма, в том числе и алклоголизма. Многие нейропептиды вовлекаются в регуляцию возрастных изменений, в т. ч. и процессов полового созревания [4].
Одним из этапов метаболизма пептидов является ограниченный протеолиз, который играет главную роль как в процессах их биосинтеза, так и в процессах инактивации. Пептидгидролазы, осуществляющие процессинг и деградацию пептидных регуляторов, обеспечивают функционирование и определенное соотношение их в организме.
Большинство предшественников нейропептидов включают последовательности пептидов, обладающих разной биологической активностью. То, какие именно пептиды будут образовываться из предшественника, зависит от набора протеиназ, действующих на молекулу предшественника, и от соотношения их активностей.
При паракринном действии пептида активность внеклеточных пептидаз определяет время жизни пептида, расстояние, на которое он может продиффундировать, а, следовательно, и спектр мишеней, на которые он действует. Таким образом, при помощи протеиназ осуществляется регуляция физиологических эффектов пептидов на этапе биосинтеза и на этапе инактивации пептидов.
Особенность пептидной регуляции функционального состояния организма состоит в том, что в каждом участке в каждый момент времени должна поддерживаться необходимая концентрация определенных пептидов. Это может быть достигнуто точной и согласованной работой протеиназ, осуществляющих синтез и деградацию пептидов, т. е. поддержанием в головном мозге определенной пространственно-временной мозаики протеолитической активности. При изменении внешних условий, или каком-либо воздействии (например, алкоголизации) эта мозаика определенным образом изменяется, чтобы обеспечить работу функциональных систем организма в новых условиях.
В конечной стадии образования активных пептидов из неактивных предшественников и в начальных стадиях их деградации участвуют основные карбоксипептидазы - ферменты, отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с С-конца пептидов. К ним, в частности, относятся карбоксипептидаза Н, и недавно открытая ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза. Им принадлежит важная роль в регуляции уровней активных нейропептидов в организме [8], чем обусловлен интерес к изучению этих ферментов, в том числе и при различных физиологических и патологических процессах, протекающих в организме [6].
Действии адреноблокирующих препаратов в первую очередь направленно на б,в-адренорецепторы. При действии на б1-адренорецепторы в клетку начинают поступать ионы кальция, оказывая прямое возбуждающее действие. Кроме того, активируется фосфолипаза С. Она расщепляет мембранный фосфолипид на два активных вещества: инозит-3-фосфат, который стимулирует выброс кальция из внутриклеточных депо в цитоплазме, и диацилглицерол, который активирует протеинкиназы. Протеинкиназы активируют фосфорилазы, которые фосфорилируют белки. При действии на в-рецепторы через регуляторный белок Gs активируется аденилатциклаза, а продукт ее работы - цАМФ активирует протеинкиназы. При действии на б2-рецептоы через белок Gi аденилатциклаза ингибируется. И Gs и Gi для своей работы требуют ГТФ.
В частности, б-адреноблокаторы оказывая прессорное действие, характеризуются наличием побоченных эффектов, таких как, артериальная гипотония, брадикардия и др., которые трудно объяснить только влиянием этого препарата на рецепторы. Возможно, часть эффектов опосредуется пептидергической системой, т.к. изменение адренергической системы вызывает изменение уровня регуляторных пептидов: вазопрессина, ангеотенизина и саматотропина.
2. Материалы и методы исследования
2.1. Материал исследования
Исследования проводили на самцах белых беспородных крыс массой 350-400г. В работе использовали две группы животных: опытную и контрольную. Животные опытной группы получали в течение двух недель в качестве единственного источника жидкости водный раствор пирроксана, содержащий 5% р-р сахарозы, при этом средняя доза препарата составляла 150мкг/кг/сут. Животные контрольной группы - 5% р-р сахарозы.
Крыс декапитировали, извлекали гипофиз, гипоталамус, стриатум, большие полушарии, четверохолмие и надпочечники.
Навески тканей гомогенизировали в 50мМ натрий-ацетатном буфере при рН = 5,6.
2.2. Методы определения карбоксипептидазо-В-подобной активности
Карбоксипептидазо-В-подобную активность определяли флюориметрическим методом Фрикер и Снайдер с модификациями. В основу метода положена различная растворимость в хлороформной и водной фазах субстрата и продукта реакции.
2.2.1. Определение активности карбоксипептидазы Н
50мкл 1% гомогената смешивали со 150мкл 50мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5.6, в случае контрольной пробы; в случае опытной пробы 50мкл 1% гомогената смешивали со 140мкл 50мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5.6 с добавлением 10мкл ГЭМЯК.
Смесь инкубировали 8 мин при 37°C. Реакцию начинали прибавлением 50мкл субстрата (DNS-фен-лей-арг, приготовленного на 50мМ натрий-ацетатном буфере при рН 5.6). Пробы перемешивали и инкубировали 60 мин при 37°C.
Реакцию останавливали добавлением 50мкл 1н р-ра HCl.
Для экстракции продукта DNS-фен-лей к пробам добавляли 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60с и центрифугировали 10мин при 1000об/мин для разделения фаз.
Измерение флюоресценции проводили на флюориметре ФМЦ-2 (лex = 360нм, лex = 530нм) в кювете толщиной 1см.
Активность КПН определяли как разность в флюоресценции проб и выражали DNS-фен-лей, образовавшегося за 1мин инкубации в расчете на 1мг белка.
2.3. Методика определения белка
Количество белка в пробах определяли по методу Лоури. Этот метод сочетает в себе биуретовую реакцию (реакцию на пептидные связи) и реакцию Фолина (на тирозин и триптофан). Метод Лоури является достаточно чувствительным (10-100мкг белка в пробе) и наиболее точным из всех существующих методов количественного определения белка.
Калибровочную кривую строили по раствору бычьего сывороточного альбумина (БСА). Для этого из исходного р-ра БСА (100мкг/мл) готовили разведения с концентрацией БСА 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90мкг/мл и определяли в них концентрацию белка по обычной схеме. График зависимости оптической плотности от концентрации белка приведен на рис.1.
Для проведения цветной реакции отбирали 0,5мл р-ра белка, приливали по 1мл реактива С, приготовленного следующим образом: р-р А (21,6г Na2CO3?10H2O и 4г NaOH растворили в 1л воды) и р-р В (0,5г CuSO4?5H2O и 1г цитрата натрия растворяли в 10мл воды) смешивали в отношении 50:1. Пробы тщательно перемешивали и выдерживали 10мин при комнатной температуре. Затем прибавляли 0,1мл 1н реактива Фолина, тщательно перемешивали и выдерживали 40мин при комнатной температуре. Пробы фотоколориметрировали на КФК-2 при л = 750нм против холостой пробы.
2.4. Статистическая обработка результатов исследования
Для оценки достоверности различий между контрольной и опытной группой использовали t-критерий Стьюдента. Это параметрический критерий, используемый для проверки гипотез о достоверности разнице средних при анализе количественных данных о популяциях с нормальным распределением и одинаковой вариантой.
Метод Стьюдента различен для независимых и зависимых выборок. Независимые выборки получаются при исследовании двух различных групп испытуемых (в нашем эксперименте это опытная и контрольная группы).
Далее в таблице значений t находят величину, соответствующую n-2 степеням свободы, где n - общее число испытуемых в обеих выборках, и сравнивают эту величину с результатом расчета по формуле.
Если полученный результат больше, чем значение для уровня достоверности 0,05, найденное в таблице, то можно отбросить нулевую гипотезу, т.е. считать разницу средних достоверной. Если же полученный при вычислении результат меньше, чем табличный, то нулевую гипотезу нельзя отбросить, и следовательно, разница средних не достоверна [5].
3. Результаты и обсуждение
Результаты исследования активности КПН и ФМСФ-КП в гипофизе, гипоталамусе, стриатуме, больших полушариях, четверохолмии и надпочечниках под влиянием пирроксана представлены на двух диаграммах.
В ходе проведения эксперимента было установлено, что получение животными пирроксана приводит к существенному снижению активности ферментов обмена регуляторных пептидов:
а) активность ФМСФ-КП падает в стреатуме, больших полушариях и надпочечниках в 7раз, а в гипоталамусе и четверохолмии в 3раза. Лишь в гипофизе наблюдается небольшое увеличение активности фермента в 2раза;
б) активность КПН уменьшается во всех пробах: в гипоталамусе в 4.5 раза, а в больших полушариях и четверохолмии в 1.5раза.
Можно пытаться толковать эти данные так, что активность ферментов обмена регуляторных пептидов может регулироваться состоянием адренергической системой, с использованием нескольких путей.
Итак, возможна регуляция через Ca2+-систему: при действии на б-адренорецепторы наблюдается изменение концентрации ионов Ca2+, но сами ионы не влияют на активность ферментов, а изменяют стабилизацию, агрегацию и способность к связыванию с мембраной. В составе фермента, а именно КПН, обнаружен участок связывания с данным ионом. Возможно, что биологическая роль растворимого и мембраносвязанного КПН отличается. Предполагают, что обе формы принимают участие в процессинге нейропептидов, но мембраносвязанная форма, наряду с этим, участвует в сортировке пептидов. Следовательно, различная концентрации Ca2+ может приводить к снижению уровня активности КПН, т.к., вероятно, происходит изменение соотношения растворимой и мембраносвязанной форм. Результатом служит влияние на процессинг и сортировку биологически активных пептидов. Аналогичный механизм будет действовать и в отношении ФМСФ-КП, так как для нее также обнаружена мембраносвязанная форма.
Возможен путь за счет изменения состояния мембраны, что ведет к изменению состояния липидного слоя и, следовательно, уменьшается активность мембаносвязанных форм изучаемых ферментов.
Наиболее важным является механизм аденилатциклазного пути, в котором внимание уделяется не цАМФ, а G-белкам. Известно, что при действии на б-адренорецепторы происходит инактивация Gi-белка и синтезироваться цАМФ не будет, т.к. не будет работать аденилатциклаза. Что приводит к уменьшению части обменных процессов, след-но, уменьшается скорость синтеза мРНК и трансляции, и результат - замедление синтеза изучаемых ферментов, в связи с тем, что считывание происходит в меньшей степени.
Разнонаправленное изменение активности ФМСФ-КП может быть вызвано с те, что в гипофизе и в гипоталамусе участвуют в образовании активных форм разных пептидов.
В целом полученные данные согласуются с литературными об изменении уровня регуляторных пептидов при введении б-адреноблокаторов.
Итак, изменение активности карбоксипептидаз через адренергическую систему может влиять на уровень регуляторных пептидов, а через пептиды - на функционирование других систем организма и, соответственно, на состояние сердечно-сосудистой системы, а также на эмоциональный статус, поведение и другие функции высшей нервной деятельности.
ВЫВОДЫ
Изучение влияния пирроксана на активность основных карбоксипептидаз в нервной ткани крыс позволило сделать следующие выводы:
Ш при введении а-адреноблокатора активность изучаемых ферментов имела тенденцию к снижению в большинстве изученных отделов;
Ш в связи с тем, что при воздействии активность КПН и ФМСФ-КП изменяется однонаправлено, то скорее всего, оба фермента обладают сходной биологической функцией;
Ш изменение активности ферментов под влиянием пирроксана указывает на то, что взаимосвязь между пептидергической и адренергической системой может осуществляться посредством изучаемых карбоксипептидаз.
Библиографический список
1. Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологические функции. - Ереван: Айастан, 1989. - 208 с
2. Азарян А.В. Пептидгидролазы нервной системы и их биологические функции //Ереван - Айастан, 1989. - 208 с.
3. Ашмарин И.П., Каменская М.А. Нейропептиды в симпатической передаче // Итоги Н. и Т. (ВИНИТИ. Сер. Физиология человека и животных). - 1988. - 34, 184 с.
4. Бабичев В.Н. Нейроэндокринный контроль процессов пубертации // Усп. совр. биол. - 1994. - 114, № 3. - С. 330-344.
5. Беляев Н.А., Колесанова Е.Ф. Динамика содержания мет-энкефалина в надпочечниках и плазме крови крыс при острой алкогольной интоксикации // Вопросы мед. химии. - 1990. - Т. 36, № 3. - С.86-87.
6. Вернигора А. Н., Генгин М. , Макарова В. В. Влияние стрессовых факторов на активность карбоксипептидазы Н в отделах головного мозга крыс // Укр. биохим. журн. - 1992. - 64. № 2. - С. 45-49. Н124.
7. Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Влияние этанола на активность карбоксипептидазы Н в гипофизе и некотрых отделах головного мозга крыс при различных стрессирующих воздействиях //Физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 1993. - Т. 79, № 3. - 34-38с.
8. Вернигора А.Н., Генгин М.Т. Протеолитические ферменты: субклеточная локализация, свойства и участие в обмене нейропептидов //Биохимия - 1996. - 61, № 5. - С. 771-785.
9. Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Никишин Н.Н. Очистка и физико-химические свойства растворимой карбоксипептидазы Н из серого вещества головного мозга кошки //Биохимия. - 1992. - Т. 57, № 11. - С. 1712-1719.
10. Вернигора А.Н., Генгин М.Т., Салдаев Д.А., Щетинина Н.В. Распределение активности фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы в нервной ткани котов // Нейрохимия. - 1997. - Т. 14, № 4. - С. 423 - 425.
11. Вернигора А.Н., Михайлова О.Е., Генгин М.Т., Рыжкова Ю.А., Мухина Е.С. Влияние хронического потребления этанола на активность основных карбоксипептидаз в отделах мозга крыс //Укр. биохим. журн., 2002. - Т. 74, № 6. - 128-130с.
12. Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние внутрибрюшинного введения физиологического раствора на поведение крыс в тесте “открытое поле” и активность ферментов обмена нейропептидов //Физиол. журнн, 1995. - Т. 81, № 12. - 121-125с.
13. Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Частичная характеристика основной фенилметилсульфонилфторид-ингибируемой карбоксипептидазы из головного мозга кошки //Биохимия. - 1995. - Т. 60, № 11. - С. 1860-1866.
14. Генгин М.Т., Вернигора А.Н. Ферменты процессинга опиоидных пептидов и методы определения их активности //Укр. биохим. журн. - 1994. - Т. 66, № 2. - С. 3-17.
15. Гомазков О.А. Функциональная биохимия регуляторных пептидов. -М: Наука. 1993. - 160 с.
16. Оболенская Н.Е. Некоторые особенности образования нейропептидов // Успехи совр. биол. - 1989. - Т. 108, № 3(5). - С. 337-341.
17. Щетинина Н.В. Активность основных карбоксипептидаз в тканях и отделах мозга крыс в онтогенезе //дис. на соиск. ученой степени кандидата биол. наук. - Спб., 1997.
18. Daud A.I., Bumpus F.M., Husain A. Characterization of angiotensin I-converting enzyme (ACE)-containing follicles in the rat ovary during the estrous cycle and effects of ACE inhibitor on ovulation //Endocrinology. - 1990. - 126, № 6. - Р. 2927-2935.
19. Fiedorek F.T.Jr., Parkinson D. Carboxypeptidase H processing and secretion in rat clonal beta-cell lines //Endocrinology. - 1992. - V. 131, № 3. - P. 1054-1062.
20. Fricker L.D., Snyder S.H. Enkephalin convertase: purification and charasterization of a specific enkephalin-synthesizing carboxypeptidase localized to adrenall chromaffin granules //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1982. - № 79. - P. 3886-3890.
21. Guest P.C., Pipeleers D., Rossier J., Rhodes C.J., Hutton J.C. Co-secretion of carboxypeptidase H and insulin from isolated rat islets of Langerhans //J. Biochem. - 1989. - V. 264, № 2. - P. 503-508.
Страницы: 1, 2
