Хоризмовая кислота
Антранилатсинтетаза
Антраниловая кислота
Фенилаланин Тирозин Триптофан
Рис. 12. Схема разветвлённого биосинтеза фен, тир, и три Candida
В связи с этой особенностью промышленное производство триптофана организовано преимущественно по двухступенчатой схеме. На первом этапе химическим способом синтезируют антраниловую кислоту, которую с помощью энзиматической системы мутантных штаммов дрожжей Candida utilis переводят в триптофан.
Кроме триптофана микробиологическим способом с использованием предшественников получают гистидин, изолейцин, метионин, серин и треонин.
Для получения аминокислот - конечных продуктов неразветвленных метаболических путей, например аргинина, ауксотрофные мутанты не используют. В этом случае применяют мутанты с дефектами регуляции биосинтеза аминокислоты, т.е. регуляторные мутанты.
Производство витаминов
Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов - продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: В2, В12, ?-каротин (провитамин А) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем.
Получение витамина В2 (рибофлавин). Вплоть до 30-х годов прошлого столетия рибофлавин выделяли из природного сырья. В наибольшей концентрации он присутствует в моркови и печени трески. Из 1 т моркови можно изолировать лишь 1 г рибофлавина, а из 1 т печени - 6 г. В 1935 г. обнаружен активный продуцент рибофлавина - гриб Eremothecium ashbyii, способный при выращивании на 1 т питательной смеси синтезировать 25 кг витамина В2. Сверхсинтеза рибофлавина добиваются действием на дикие штаммы мутагенов, нарушающих механизм ретроингибирования синтеза витамина В2, флавиновыми нуклеотидами. Отбор мутантов ведут по устойчивости к аналогу витамина В2 - розеофлавину.
В 1983 г. во ВНИИ генетики микроорганизмов сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, характеризующийся увеличенной дозой оперонов, которые контролируют синтез рибофлавина. Клонированием генов рибофлавинового оперона в одной из созданных плазмид был получен производственный штамм-продуцент витамина В2, способный синтезировать втрое большее по сравнению с E. ashbyii количество рибофлавина всего за 40 ч ферментации.
Получение витамина В12 (цианокобамид). Первоначально витамин В12 получали исключительно из природного сырья, но из 1 т печени можно было выделить всего лишь 15 мг витамина. Единственный способ его получения в настоящее время - микробиологический синтез. Обнаружение витамина в качестве побочного продукта при производстве антибиотиков в значительной степени стимулировало поиск организмов-продуцентов витамина и изучение путей его образования. Однако механизмы регуляции биосинтеза витамина В12 до настоящего времени полностью не расшифрованы. Известно, что при высоких концентрациях витамин полностью репрессирует синтез ключевых ферментов своего новообразования.
Продуцентами витамина В12 при его промышленном получении служат актиномицеты, метанобразующие и фотосинтезирующие бактерии, одноклеточные водоросли. В 70-х годах ХХ в. интерес ученых привлекли пропионовокислые бактерии, известные ещё с 1906 г. и широко использующиеся при приготовлении препаратов животноводства. Выделено 14 видов пропионовокислых бактерий, продуцирующих витамин В12.
Получение ?-каротина и витамина D2. ?-Каротин можно выделить из ряда растительных объектов - моркови, тыквы, облепихи, люцерны. В начале 60-х годов ХХ в. разработана схема микробиологического синтеза ?-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы - фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи - синтезируют каротин. Характерно, что содержание ?-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг ?-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora - 3-8 тыс. мкг.
Микробиологическим способом получают и витамин D2 (эргокальциферол), при производстве которого освоено дешевое сырье (углеводороды) и установлен стимулирующий эффект ультрафиолетовых лучей на синтез эргостерина культурой дрожжей.
Производство органических кислот
Получение лимонной кислоты. Лимонную кислоту широко используют в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности. Ею заменяют фосфаты в составе детергентов, так как она полностью метаболизируется живыми организмами. Лимонная кислота образует хелаты с металлами, поэтому её применяют для их очистки. Объем мирового производства цитрата составляет 400 тыс. т/год. Производство лимонной кислоты принадлежит к числу старейших промышленных микробиологических процессов: оно было организовано в 1893 г.
Для промышленного производства лимонной кислоты используют главным образом культуру гриба Aspergillus niger. Метаболическим источником лимонной кислоты в организме служит цикл трикарбоновых кислот. Реакция образования лимонной кислоты, катализируемая цитратсинтазой, открывает цикл Кребса. Цитратсинтаза определяет скорость реакций, составляющих цикл Кребса. Активность фермента зависит от концентрации ЩУК, содержание которой может поддерживаться за счет функционирования конститутивной пируваткарбоксилазы, обеспечивающей переключение в аэробных условиях процессов гликолиза и глиоксилевого цикла. Скорость оборота цикла Кребса определяется поддержанием необходимого уровня окисленных форм коферментов дегидрогеназ, поэтому высокий выход цитрата получается лишь при условии хорошей аэрации. Дефицит фосфата ведет к сверхпродукции цитрата.
Одновременно с лимонной было налажено производство молочной кислоты при участии молочнокислых бактерий рода Lactobacillus.
С 20-х годов налажено промышленное производство D-глюконовой кислоты из глюкозы при участии A.niger. Глюконат натрия, в виде которого обычно выделяют глюконовую кислоту, используют для извлечения металлов, борьбы со ржавчиной, как моющее средство и в качестве медицинского препарата.
Производства, основанные на ацетон-бутанольном брожении и микробиологическая конверсия этанола в ацетат в настоящее время не рентабельны по экономическим соображениям.
Биотехнология получения вторичных метаболитов
Биосинтез вторичных метаболитов фазоспецифичен и происходит по завершении стадии роста, в идиофазе, благодаря чему их ещё называют идиолитами. Среди вторичных метаболитов ведущее место по объему производства занимают антибиотики.
Получение антибиотиков
Организация крупномасштабного производства антибиотиков сыграла решающую роль в становлении промышленной биотехнологии. К антибиотикам относятся низкомолекулярные эффекторы изначально природного происхождения, способные подавлять рост живых клеток. Способность нитчатого гриба зеленой плесени Penicillium notatum вызывать гибель микроорганизмов впервые была установлена в 1928 г. английским микробиологом А. Флеммингом. Однако лечебные свойства этой плесени были описаны ещё в 1871 г. русским дерматологом А.Г. Полотебновым. Количество открываемых антибиотиков постоянно растет. В 1940 г. было известно всего 6 антибиотиков, а в настоящее время описано более 12 000 аналогичных соединений, из которых в клинике применяют около 200 препаратов. 97% известных антибиотиков токсичны, поэтому в практике не используются. Изыскание новых антибиотиков обусловлено как потребностями практики, так и накоплением резистентных форм микроорганизмов по отношению ко многим антибиотикам.
Главное направление получения новых антибиотиков состоит в химической трансформации природных молекул для создания полусинтетических антибиотиков. Методы получения антибиотиков путем химического синтеза чрезвычайно сложны и не могут конкурировать с их биосинтезом методами биотехнологии. Направленный биосинтез антибиотиков осуществляется путем прямой ферментации микроорганизма - продуцента с подходящим предшественником, что индуцирует синтез ферментов вторичного метаболизма в идиофазе. Вводимый предшественник должен лимитировать скорость биосинтеза антибиотика. Например, производство бензилпенициллина в значительной степени стимулируется добавками его метаболического предшественника - фенилуксусной кислоты; пропионовая кислота и пропиловый спирт инициируют биосинтез макролидов через метилмалонилКоА; L-фенилаланин - предшественник фенилаланина - ускоряет образование грамицидина S. Аналогичный эффект вызывает использование ингибиторов метаболизма. Так, при подавлении процесса введения хлора микроорганизм S. aureofaciens образует тетрациклин, а не хлортетрациклин.
Другой способ получения антибиотиков состоит в использовании для их биосинтеза блокированных мутантов, у которых отсутствует (блокировано) определенное звено в цепи реакций, ведущих к синтезу антибиотика. Блокированные мутанты не способны образовывать нужный антибиотик. Используя низкую субстратную специфичность ферментов вторичного метаболизма и вводя аналоги предшественников антибиотика, последние переводят в аналоги самого антибиотика в ходе процесса, известного как мутационный биосинтез или мутасинтез. Так, мутанты Nocardia mtditerranei, у которых нарушена способность к ацилированию, образуют аналог предшественника рифамицина В-рифамицин SV.
Особенно успешны разработки в области биосинтеза полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов. Получение новых более эффективных аналогов пенициллина основано на изменении природы его ацильной группировки при сохранении в неизменном виде ядра пенициллина - 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК). В промышленности 6-АПК получают путем гидролиза природных пенициллинов с помощью специфического фермента - пенициллинацилазы. Некоторые из ацилаз способны катализировать и обратные реакции - процессы ацилирования аминогруппы 6-АПК с образованием модифицированного пенициллина. Таким путем было получено более 4000 полусинтетических пенициллинов.
Получение промышленно важных стероидов
Способность клеток микроорганизмов к сложнейшим процессам биотрансформации наиболее полно реализовалась при получении промышленно важных стероидов. Биотрансформация стероидов обычно заключается в селективном воздействии на одно из положений стероидного скелета. Первый промышленный процесс (1937 г.) микробной биотрансформации стероидов основывался на технологии направленного гидроксилирования (11-?-гидроксилирование) прогестерона.
Важнейший источник стероидных гормонов (эндостраны и эстраны) - культура клеток растений. Так, культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea) корневого происхождения продуцирует фитостерин диосгенин и его гликозидные производные (сапонины). Дальнейшие успехи в производстве стероидных препаратов связывают с применением иммобилизованных клеток.
1.5 Основы биологической переработки отходов
Специфическое применение биотехнологических методов для решения проблем окружающей среды, таких, как переработка отходов, очистка воды, устранение загрязнений, составляет предмет экологической биотехнологии.
Получение биогаза
Биогаз - это смесь из 65% метана, 30% СО2, 1% сероводорода. Энергия, заключенная в 28м3 биогаза, эквивалентна энергии: 16,8м3 природного газа; 20,8 л нефти. В основе получения биогаза лежит процесс метанового брожения или биометаногенез.
Биометаногенез - сложный микробиологический процесс, в котором органическое вещество разлагается до диоксида углерода и метана в анаэробных условиях[7]. Микробиологическому анаэробному разложению поддаются практически все соединения природного происхождения. В анаэробном процессе биометаногенеза выделяют три последовательные стадии, в которых участвуют свыше 190 различных микроорганизмов. На первой стадии под влиянием экстрацеллюлярных ферментов ферментативному гидролизу подвергаются сложные многоуглеродные соединения - белки, липиды и полисахариды. На второй стадии (ацидогенез) в процессе ферментации участвуют две группы микроорганизмов: ацетогенные и гомоацетатные. Ацетогенные Н2-продуцирующие микроорганизмы ферментируют моносахариды, спирты и органические кислоты с образованием Н2, СО2, низших жирных кислот, в основном ацетата, спиртов и некоторых других низкомолекулярных соединений. Гомоацетатные микроорганизмы усваивают Н2 и СО2, а также некоторые одноуглеродные соединения через стадию образования ацетил-КоА и превращают его в низкомолекулярные кислоты, в основном в ацетат. На заключительной третьей стадии анаэробного разложения отходов образуется метан. Он может синтезироваться через стадию восстановления СО2 молекулярным водородом, а также из метильной группы ацетата.
4Н2 + СО2 = СН4 + 2Н2О
3Н2 + СО = СН4 + Н2О
2Н2О + 4СО = СН4 + 3СО2
4НСООН = СН4 + 3СО2+ 2Н2О
4 СН3ОН = 3СН4 + СО2+ 2Н2О
СН3СООН = СН4 + СО2
90-95% используемого углерода метанобразующие бактерии превращают в метан и лишь 5-10% углерода превращаются в биомассу. Процесс ведется при температуре 30-60?С и рН 6-8. Этот способ получения биогаза широко применяют в Индии, Китае, Японии. В настоящее время для производства биогаза чаще используют вторичные отходы (отходы животноводства и сточные воды городов), чем первичные (отходы зерноводства, полеводства), обладающие сравнительно низкой реакционной способностью и нуждающиеся в предварительной обработке. Основное преимущество биогаза состоит в том, что он является возобновляемым и экологически чистым источником энергии.
Очистка сточных вод
Методы очистки сточных вод [4]:
1. Механические методы. Сущность этих методов состоит в том, что из сточных вод путем отстаивания и фильтрации удаляют механические примеси. Механическая очистка позволяет выделять из бытовых сточных вод до 60-75% нерастворимых примесей, а из промышленных - до 95%.
2. Химический метод. В сточные воды добавляют различные реагенты (AL2(SO4)3), которые вступают в реакцию с загрязнителями и осаждают их в виде нерастворимых осадков. Химическая очистка уменьшает количество нерастворимых примесей до 95%, а растворимых - до 25%.
3. Физико-химические методы используют для удаления тонкодисперсных и растворенных неорганических примесей, а также разрушения органических и плохо окисляемых веществ. В арсенал этих методов входят электролиз, окисление, сорбция, экстракция, ионообменная хроматография, ультразвук, высокое давление и др.
4. Биологический метод основан на использовании закономерностей биохимического и физиологического самоочищения рек и других водоемов. Для очистки сточных вод используют биофильтры, биологические пруды и аэротенки.
В биофильтрах (перколяционные фильтры известны с1890г.) сточные воды пропускают через слой крупнозернистого материала, покрытого тонкой бактериальной пленкой, благодаря которой интенсивно протекают процессы биологического окисления. С 1970 г. на смену клинкеру и гравию, в качестве пористого материала, пришли пластмассы.
Аэротенки - огромные резервуары из железобетона, в которых очистка происходит с помощью активного ила (известен с 1914 г.) из бактерий и микроскопических животных, которые бурно развиваются в этих сооружениях, чему способствуют органические вещества сточных вод и избыток кислорода, поступающего с потоком подаваемого воздуха. Процесс более эффективен, чем фильтрация, но характеризуется высокими эксплуатационными расходами (аэрация).
С 1980 г. и по сей день в технологии очистки сточных вод применяется принцип «псевдоожиженного слоя» - сочетание первых двух систем. Реализуется этот принцип в уловителе Саймона-Хартли (периодическое наращивание биомассы проводят в пустотах пористого полиэфира) и оксигенаторе Дорра - Оливера (подложкой служит песок).
После биоочистки проводят хлорирование жидким хлором или хлорной известью. Для дезинфекции используют также ультразвук, озонирование, электролиз.
Микробное выщелачивание
Методы извлечения меди из пород, содержащих минералы, путем обработки их кислыми растворами используются уже много веков. Однако лишь в 50-е и 60-е годы ХХ века выяснилось, что в получении металлов из минералов решающую роль играют бактерии[4]. В 1947 г. Колмер и Хинкл выделили из шахтных дренажных вод бактерию Tiobacillus ferrooxydans. Этот организм окислял двухвалентное железо и восстанавливал серосодержащие соединения, а также, возможно, и некоторые металлы. Вскоре оказалось, что он участвует в переводе меди из рудных минералов в раствор.
Окислительным процессом, катализируемым бактериями, является окисление железа,
4FeSO2 + O2 + 2H2SO4 = 2Fe2 (SO4)3 + 2H2O, (1)
и окисление серы,
S8 + 12O2 + 8H2O = 8H2SO4. (2)
Ряд минералов непосредственно окисляется некоторыми выщелачивающими организмами. Примерами такого рода могут быть окисление пирита,
2FeS2 + 15O2 + 2H2O = 2Fe2 (SO4)3 + 2H2SO4, (3)
и сфалерита,
ZnS + 2O2 = ZnSO4. (4)
Ион трехвалентного железа служит сильным окисляющим агентом, переводящим в раствор многие минералы, например халькоцит,
Cu2S + 2Fe2 (SO4)3 = 2CuSO4 + 2Fe2SO4 +S?, (5)
и уранинит,
UO2 + Fe2 (SO4)3 = UO2SO4 + 2FeSO4. (6)
Выщелачивание, происходящее при участии иона трехвалентного железа, который образуется в результате жизнедеятельности бактерий, называют «непрямой» экстракцией. В настоящее время бактериальное выщелачивание, известное также как биогидрометаллургия или биоэкстрактивная металлургия, применяется в промышленных масштабах для перевода в растворимую форму меди и урана.
Выщелачивание медных отвалов. Для начала процесса выщелачивания отвал смачивают водой, подкисленной серной кислотой до рН 1,5-3,0. Этот кислый раствор, или «выщелачиватель», просачивается сквозь бедную руду или отвальные материалы. Он содержит кислород и углекислый газ и создает благоприятную среду для размножения ацидофильных гиобацилл, широко распространенных в сульфидных рудах. В некоторых случаях содержание Tiobacillus ferrooxydans превышает 106 клеток на 1 кг породы и на 1 мл выщелачивающего раствора. Этот организм активно окисляет растворимые ионы двухвалентного железа (1) и воздействует на серу - и железосодержащие минералы (2) (3). При окислении медно-сульфидных минералов нередко образуется элементарная сера (5). Эта сера маскирует частицы минералов, ограничивая воздействие на них со стороны трехвалентного железа. T. Ferrooxydans, присутствующая в количестве 103-105 клеток на 1 г породы и на 1 мл выщелачивающего раствора, окисляет некоторые растворимые соединения серы и элементарную серу (2). Разрушение серы этим организмом приводит к удалению маскирующего слоя серы, окружающего некоторые частицы минералов, и усиливает процесс выщелачивания. Из выщелачиваемых отвалов вытекают растворы, содержащие 0,75-2,2 г меди в 1 л. Эти растворы направляют в отстойники; медь из них получают путем осаждения с использованием железа или экстракцией растворителями. «Отработанные» выщелачивающие растворы вновь поступают в отвал.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
