Актинобациллезная (гемофилезная)

Наиболее удобно в этом случае использовать кровяной сгусток на агаре

Цинссера или сывороточном агаре.

Испытание различных видов питающих культур бактерий как продуцентов

НАД показало, сто ростовой фактор экскретируют в достаточных количествах

интенсивно растущие виды бактерий (эшерихии, сапрофитные бациллы,

стафилококки), которые обеспечивают зону от 16,8 ± 0,89 мм до 31,6 ± 1,14мм

в зависимости от вида бактерий и типа питательной среды.

Однако, при использовании культур стафилококков, установили, что

некоторые из них ингибируют сателлитный рост A.pleuropneumoniae. Мы не

обнаружили описание подобного феномена, хотя он известен у P.multjcida. Но

в литературе есть сообщения о наличии гиалуроновой кислоты в составе

капсулы некоторых штаммов A.pleuropneumoniae. Следовательно, причиной

ингибиции роста может быть синтез культурой стафилококка гиалуронидазы. Мы

также не исключаем вероятность образования продуцентом НАД соединений типа

НАД-азы. В любом случае, питающая культура бактерий должна быть

предварительно проверена по указанному критерию.

Определение НАД - зависимости – важный этап в идентификации

A.pleuropneumoniae (1-й биовар) и H.parasuis. Наши данные о том, что

референтные и эпизоотические культуры A.pleuropneumoniae периодически могут

утрачивать НАД- зависимость, причём это касается любого штамма 1-го

биовара. Явление НАД -зависимости может быть восстановлено у культур,

утративших это свойство, путём культивирования на «обеднённой» питательной

среде с локальным источником НАД. Следовательно на обычных питательных

средах животного происхождения культуры, потерявшие НАД зависимость,

утилизируют какие-то предшественники НАД, отсутствующие, например, в

глюкозо-казеиновом агаре. На последней питательной среде их рост возможен

только в присутствии НАД, зависимость от которого они приобретают вновь.

Результаты исследований по изучению НАД - зависимости гемофильных

бактерий позволили нам дать оценку и рекомендовать для практических целей

сочетание питательных сред, позволяющих в условиях диагностической

лаборатории тестировать V - и Х - зависимость.

Исследования показали отсутствие СО2 - зависимости у изученных

культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae, а также не удалось обнаружить

существенных различий в частоте изоляции культур из патологического

материала в условиях обычной атмосферы и повышенного содержания СО2 . Оба

вида бактерий показали сильную зависимость от наличия в питательной среде

сыворотки крови. У H.parasuis эта потребность выражена сильнее, чем у

A.pleuropneumoniae. При отсутствии в питательном субстрате сыворотки крови

оба вида бактерий быстро диссоциируют.

Количественные показатели, характеризующие рост A.pleuropneumoniae и

H.parasuis в жидкой питательной среде (бульон Хоттингера, 120мг % аминного

азота, рН 7,6,5,% сыворотки крови крупного рогатого скота, 10% дрожжевого

экстракта), свидетельствуют о более интенсивном росте первого вида, в

частности, период генерации соответственно составил 40,8 и 67 минут,

удельная скорость роста 1,008 и 0,622, прирост бактериальных клеток за 1

час культивирования 0,44 и 0,27 log.

Оценка питательных сред для первичной изоляции культур H.parasuis и

A.pleuropneumoniae (1-й биовар) показала, что для этой цели могут быть

использованы агар и бульон Левинталя, «шоколадный» агар, сывороточно-

дрожжевой бульон и агар, сывороточный и кровяной агар, с локальными

источниками V - ростового фактора. Предпочтительнее использование

прозрачных питательных сред, позволяющих получать более полную информацию

об особенностях колонии. Использование сред с локальными источниками НАД

даёт важную информацию на первом этапе бактериологического исследования о

НАД -зависимости, а в случае кровяного агара - также о гемолитической

активности бактерий. Применение питающих бактерий как источника НАД требует

отвивки культур в течении 24-48 часов из-за быстрой их гибели под влиянием

метаболитов «баккормилок». Подращивание материала в течении 6-8 часов в

сывороточно - дрожжевом бульоне, содержащем бацитрацин, с последующим

рассевом на среды увеличивает вероятность выделения культур НАД--зависимых

бактерий.

Для поддержания культур H.parasuis и A.pleuropneumoniae при текущей

работе в наибольшей степени подходят оптимальные плотные питательные среды

с заливкой культур вазелиновым маслом при температуре хранения 5-8(С.

Наиболее длительно сохраняют жизнеспособность (6-7 недель) культуры,

выращенные в сгустках крови и сохраняемые в замороженном состоянии.

2.1.2. Методы и результаты идентификации НАД--зависимых бактерий,

выделенных от свиней, по культурально - морфологическим, ферментативным и

генетическим свойствам.

Исследование ферментативных свойств НАД – и гемин – зависимых культур

бактерий проводили на рутинных дифференциально-диагностических средах с

добавлением ростовых факторов, а также на жидких средах Гисса в

микрообъёмах и диагностических системах ПБДЭ и СИБ Горьковского НИЭМ.

Максимальное совпадение результатов было получено на общепринятых средах, в

ПБДЭ и микрообъёмах.

Таксономическое положение 165 культур НАД--зависимых бактерий,

выделенных от клинически здоровых свиней, а также животных с явлениями

фибриозно-геморрагической плевропневмонии или генерализованных серозитов,

было исследовано при помощи нумерического анализа. В качестве опорных в

данную коллекцию культур были включены типовые штаммы Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae, H.parasuis, H.parainfluenzae,

H.influenzae, A.ligieresii, A.suis. У каждого исследованного штамма были

определены 57 фенотипических признаков, характеризующих их культуральные и

ферментативные свойства. Все полученные данные были преобразованы в

числовую форму, подвергнуты нумерическому анализу свиноводства конечным

представлением полученных результатов в виде дендрограммы.

Анализ дендрограммы показал, что все культуры объединяются в единый

массив при уровне сходства 75,02%, после чего они подразделяются на два

больших фенона: один с уровнем сходства 81,87%, включающий типовые штаммы

A.lignieresii, A.suis, Haemophilus, (Actinobacillus), pleuropneumoniae и

типовой штамм «малой группы» (фенон «А»), второй с уровнем подобия 81,997%

включает типовые штаммы H.influenzae, H.parainfluenzae и H.parasuis (фенон

«Н»). Из фенона «А», объединяющего культуры актинобацилл на уровне подобия

91,23%, выделяется фенон №1, включающий виды A.lignieresii и A.suis, и на

уровне сходства 95,00% выделяется фенон №2, объединяющий эпизоотические

культуры вокруг типового штамма «малой группы». При уровне подобия 89,48%

формируется фенон №3, объединяющий эпизоотические штаммы вокруг типовых

культур Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

В феноне «Н» на уровне сходства 81,997% выделяется фенон №4-

-H.influenzae, на уровне 87,63% - фенон №5, объединяющий штаммы

H.parainfluenzae и на уровне подобия 89,60% вокруг типовых штаммов

H.parasuis концентрируется другая группа эпизоотических штаммов -

-фенон №6.

Следовательно, массив эпизоотических штаммов дифференцируется на три

фенотипические группы, соответствующие видам Haemophilus (Actinobacillus)

pleuropneumoniae, H.parasuis и «малой группе» гемофильных бактерий.

Полученные данные свидетельствуют о тяготении культур Haemophilus

pleuropneumoniae не к роду Haemophilus, а к роду Actinobacillus.

С целью уточнения таксономического положения эпизоотических штаммов,

классифицированных по фенотипическим свойствам как Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae, НАД--зависимых бактерий, обозначаемых

как Pasteurella-haemolytica- подобные бактерии, был определён нуклеотидный

состав и уровень гомологии ДНК культур этих групп свиноводства

представителями рода Haemophilus (H.parasuis, шт.J 95-таксон «С»),

Pasteurella (P.multocida), Actinobacillus (A.suis), а также с типовыми

культурами Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae.

Результаты показали, что все исследованные штаммы по ГЦ -составу

образуют довольно однородную группу свиноводства крайними значениями 39,8 -

43,2 ([pic]=41,3(0,2). Такие значения вполне соответствуют приводимым в

Руководстве Берги для семейства Pasteurellaceae. Несколько более высокий ГЦ

состава обнаружен у P.haemolytica - подобных бактерий (42,5(0,5) по

сравнению с типовыми штаммами A.pleuropneumoniae, (40,7(0,5).

Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae имели

показатель 41,2(0,1 мол% ГЦ.

Уровень гомологии ДНК внутри группы P.haemolytica - подобных штаммов

составил 100%; ДНК бактерий этой группы (шт.2288/77) имела гомологию с ДНК

типовых штаммов A.pleuropneumoniae - 75%; с ДНК A.suis - 33%, с ДНК

P.multocida и H.parasuis не более 9%; с ДНК эпизоотических штаммов

Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae - 75—83%.

Эпизоотические штаммы Haemophilus (Actinobacillus) pleuropneumoniae

по данным гибридизации ДНК образуют генетически взаимосвязанную группу с

уровнем подобия нуклеотидных последовательностей – 75-100%. В то же время

бактерии этой группы тесно связаны с типовыми штаммами Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae (78-98%), на уровне 33-38% гомологичных

нуклеоидных последовательностей с ДНК A.suis , и только на уровне гомологии

ДНК 5-9% с H.parasuis и 3-10% c P.multocida.

При интерпретации полученных результатов мы исходили из критериев

генетического анализа, предложенных Медниковым и соавт.(1974), согласно

которым культуры P.haemolytica - подобных бактерий не имеющие

НАД—зависимости, могут рассматриваться как биовар Haemophilus

(Actinobacillus) pleuropneumoniae. В целом эпизоотические штаммы,

выделенные при фибринозно - геморрагических пневмониях, P.haemolytica -

подобные бактерии и типовые штаммы Haemophilus (Actinobacillus)

pleuropneumoniae предстают как видовая общность с заметной внутривидовой

гетерогенностью. Подобный внутривидовой уровень гетерогенности не исключает

выделения дополнительных внутривидовых таксонов, кроме НАД—зависимого и -

независимого биоваров.

Полученные данные свидетельствуют, что культуры A.pleuropneumoniae,

обозначаемые в 9-м издании Руководства по систематике бактерий Берги как

видов рода Haemophilus, не относятся к нему, а также штамм J95 (таксон

«С»), упоминаемый в числе видов рода Haemophilus, по данным гибридизации

также не относится к роду Haemophilus.

На основании результатов нумерического анализа, с учётом частоты

встречаемости тех или иных положительных ферментативных реакций, для

идентификации НАД--зависимых бактерий, выделяемых при пневмониях и

генерализованных серозитах свиней, рекомендованы в качестве основных

дифференциальных признаков (кроме культуральных): НАД—зависимость,

образование уреазы, щелочной фосфатазы, гемолизина, кислоты из ксилозы,

маннита и маннозы. Остальные ферментативные признаки можно рассматривать

как дополнительные.

Потеря культурами A.pleuropneumoniae НАД—зависимости и признание

существования НАД—независимого биовара этого вида бактерий делает

неприемлемой схему идентификации, предлагаемую для НАД--зависимых культур.

Неизбежно расширяется число бактериальных видов, от которых необходимо

дифференцировать НАД - независимые культуры A.pleuropneumoniae. Ситуация

осложняется тем, что сходные патологоанатомические изменения в лёгких могут

вызвать другие виды бактерий. В опытах экспериментального (интраназального)

заражения свиней сходные изменения в легких были обнаружены при инокуляции

культур A.pleuropneumoniae НАД—зависимого и - независимого биоваров, A.suis

и бактерий «малой группы». Данное обстоятельство увеличивает значение

бактериологического исследования в диагностике болезни. Сравнительное

изучение физиологических свойств A.pleuropneumoniae (1 и 2 биовары),

A.suis, P.multocida и B.bronchiseptica как видов сходных и достаточно часто

обнаруживаемых при пневмониях свиней позволило нам отобрать для их

дифференциации следующий минимальный набор признаков: липкость колоний и

вязкость бульона, наличие капсулы и жгутиков, гемолитическая и уреазная

активность, образование щелочной фосфатазы, индола, кислоты из маннита,

сорбита, салицина, мелибиозы, утилизации цитратов.

3. Патогенные свойства A.pleuropneumoniae.

Исследовали патогенность данного вида бактерий для лабораторных

животных и свиней.

При испытаниях различных способов заражения морских свинок культурами

A.pleuropneumoniae животные этого вида оказались наиболее чувствительны

культур интраназальной инокуляции (ЛД50=125млн.м.к.), менее чувствительны –

к внутрибрюшинному (ЛД50=1,585 млрд.м.к.) и малочувствительны к подкожному

заражению. Сравнительная оценка вирулентности девяти штаммов

A.pleuropneumoniae при интраназальном способе инокуляции по критерию объёма

поражённой лёгочной ткани показала наибольшую вирулентность культур 1,4,5

сероваров и существенно меньшую у культуры серовара 3; культуры серовара 2

показали штаммовые различия. Патологоанатомические изменения при

интраназальном заражении морских свинок характеризовались развитием

фиброзно-геморрагической пневмонии.

В отличие от морских свинок белые мыши оказались более чувствительны

к внутрибрюшинному заражению: ЛД50 составила для культуры [pic] [pic] [pic]

изменения в лёгких у заражённых мышей характеризовались развитием

геморрагической пневмонии. Отличительной особенностью явилось практически

полное отсутствие отложений фибрина на плевре и перикарде. В целом

прослеживается видовые отличия изменений в лёгких при актинобациллёзной

пневмонии: в воспалительном экссудате максимальное количество фибрина

отмечается у свиней, меньше - у морских свинок и практически отсутствует у

мышей.

Полученные результаты свидетельствуют, что морские свинки и белые

мыши могут быть использованы в качестве лабораторной модели при изучении

вирулентности штаммов возбудителя, вопросов пато - и иммуногенеза.

Испытание различных способов заражения 2-2,5 - месячных свиней

показало их чувствительность к интраназальному и трахеальному способам

введения возбудителя при устойчивости к подкожной инокуляции культур.

Заболевание удалось также воспроизвести контактным путем. При

интраназальном и трахеальном заражении (доза [pic]) инкубационный период

составил 3 - 6 часов, контактном - 72 часа. При всех способах заражения

однотипные изменения в виде фибринозно - геморрагической пневмонии отмечали

в лёгких. Это свидетельствует, что естественными входными воротами

возбудителя являются дыхательные пути.

При оценке патогенности для свиней культур возбудителя различных

сероваров (сер. 1,2,3,4,5) установили, что колебания вирулентности больше

отражают штаммовые различия или состояние культуры на момент исследования,

чем серовариантную принадлежность. Только культура серовара 3 в опытах на

свиньях и лабораторных животных закономерно показывала меньшую

вирулентность, чем штаммы других сероваров. Титрация культуры

эпизоотического штамма возбудителя на свиньях (интраназальное заражение)

показала ЛД50 на уровне [pic] м.к.

На результаты заражения свиней влияет возраст культуры бактерий. При

интраназальном заражении свиней одинаковой дозой 6 - и 18 - часовых культур

([pic]) инкубационный период, соответственно, составил 3 и 7 часов, среднее

время от заражения до гибели животных – 48,5 и 103 часа, количества

летальных исходов –100% и 50%, объём поражённой лёгочной ткани - 70% и

47,5%, что свидетельствует о разной вирулентности культуры одного штамма на

различных стадиях развития популяции.

Помимо свойств заражающей культуры возбудителя на течение и исход

болезни влияют факторы внешней среды. В эксперименте показано значение

факторов микроклимата. Двенадцать заражённых одной культурой свиней

содержали в условиях микроклимата, соответствующего зоогигиеническим

нормам, (группа А) и свиноводства отклонениями (группа Б). В группах А и Б

соответственно всего пало 66,6% и 100% свиней, из них в течении 24 часов –

33,3% и 66,6%. Среднее время от заражения до гибели в группах составило

67,5 и 27,3 часа. Объём поражённой лёгочной ткани - 32,2(12,1% и 59,5(5,9%.

Различия по последнему показателю в группах А и Б статистически достоверны

(р(0,01).

В опытах экспериментального воспроизведения актинобациллёзной

пневмонии на морских свинках, свиньях, а также при исследовании животных,

павших в условиях неблагополучного хозяйства, исследована диссеминация

возбудителя.

При летальном исходе у свиней наиболее часто культуры возбудителя

изолировали из поражённых участков лёгочной паренхимы (100%), бронхиальных

и средостенных лимфатических узлов (63,33 - 100%), реже – из печени,

селезёнки, почек, костного мозга, крови, головного мозга. Полученные данные

определяют характер материала, отбираемого для бактериологического

исследования.

Исследования экспериментально заражённых морских свинок

(интраназальная инокуляция) показало, что изменения в лёгких в виде

очаговой гиперемии в зоне ветвлений крупных и средних бронхов развиваются

уже через час после инокуляции культуры. Возбудитель на это стадии

Страницы: 1, 2, 3, 4



Реклама
В соцсетях
рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать