В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих (предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И. , 1941), очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и амфибиями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК
В агарозном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере ТАЕ, имеющем состав: 0. 04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др. , 1984).
В полиакриламидном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0, 5-кратном буфере ТБЕ, имеющем состав: 0, 089 М трис-борат, 0, 089 М борная кислота, 2 мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10% раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др. , 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ
Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.
Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0, 5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК (2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8, 0 (Маниатис и др. , 1984). Адсорбция на кремниевой пудре.
Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300 мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8, 0, 2, 5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).
Замораживание - оттаивание.
Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при 12000 g в течение 10 мин.
ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ
500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при 100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7, 5, 6, 6 мМ MgCl2 и 1, 0 мМ 2-меркаптоэтанол), 0, 1-0, 5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12 е. а. ) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10 (Маниатис и др. , 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
Клетки Escherichia coli, выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl, 1% бакто-триптон, 0, 5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7, 5) (среда LB) с ампициллином (50 мкг/мл), осаждали центрифугированием при 4000 g. Затем осадок суспендировали в буфере STET (8% сахароза, 0, 5% тритон X-100, 10 мМ трис-HCl и 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8, 0) и добавляли лизоцим до концентрации 0, 8 г/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и при 100оС в течение 1 мин. После этого клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин.
Для осаждения плазмидной ДНК к супернатанту добавляли 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия, равный объем изопропанола и центрифугировали при 16000 g в течение 15 мин при 20оС. Затем промывали осадок добавлением 80% этанола и повторным центрифугированием в течение 5 мин при 20оС (Маниатис и др. , 1984).
ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl
На каждые 10 мл раствора плазмидной ДНК, полученного после осаждения лизированных клеток (см. Выделение плазмидной ДНК), добавляли 1 г сухого CsCl, соль растворяли, после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0, 8 мл раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Смесь помещали в центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и бромистого этидия той же плотности и центрифугировали в роторе Ti 60 при 45000 об/мин и температуре 20оС в течение 36 часов. После этого отбирали кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола, предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl.
ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, добавив равный объем 1 М раствора NH4Cl и два объема этанола. После промывания этанолом осадок ДНК растворяли в воде до концентрации 1 мкг/мкл (Маниатис и др. , 1984).
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Химическая трансформация.
Для подготовки компетентных клеток E. coliштамм XL-1 Blue MRF ' и выращивали в 100 мл 2-кратной среды Луриа (2% бакто-триптон, 1% бакто-дрожжевой экстракт, 0, 1% NaCl, 0, 4% глюкоза, рН 7, 0) при 37оС до оптической плотности D550=0, 35. Клеточную суспензию выдерживали при 0оС в течение 2 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4оС и суспендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl2, 70 мМ MnCl2, 40 мМ NaAc, рН 5, 5). После этого суспензию клеток выдерживали при 0оС в течение 30 мин, после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А с 15% глицерина.
Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др. , 1988).
Электротрансформация.
Для подготовки компетентных клеток E. coliштамм XL-1 Blue MRF ' выращивали в 100 мл среды LB (см. Химическая трансформация) при комнатной температуре до оптической плотности D550=0, 45. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, 4оС и промывали суспендированием последовательно в 100 мл, 50 мл и 10мл 10% раствора глицерина при 0-4оС. После этого клетки суспендировали в 240 мкл ледяного раствора GYT (10% глицерин, 0, 125% бакто-дрожжевой экстракт, 0, 25% бакто-триптон). Для трансформации к 40 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 1 мкл ДНК вектора (50 нг) при 0-4оС и пропускали электрический разряд (U=18000 В). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон, 0, 5% бакто-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2, 5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза), перемешивали, переносили в 3 мл среды SOC, прогретой до 42оС, и инкубировали при 37оС в течение 1 часа (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ
Кровь собирали на холоду через каудальную артерию с добавлением на каждые 5 мл крови 1 мл 2, 7% раствора Na2ЭДТА, рН 7, 4. К выделенной крови добавляли равный объем трис-солевого буфера (TBS) (0, 14 М NaCl, 5 мМ KCl, 25 мМ трис-HCl, рН 7, 4). Смесь наносили при комнатной температуре на равный объем среды для выделения лейкоцитов, содержащей 24 части 9% фикола и 10 частей 34% верографина. После центрифугирования при 400 g в течение 30 мин отбирали слой лейкоцитов и разводили в большом объеме буфера TBS. После повторного центрифугирования при 300 g в течение 40 мин для лизиса остаточных эритроцитов клетки суспендировали в растворе, содержащем 9 объемов 0, 83% раствора NH4Cl и 1 объем 2, 06% раствора трис-HCl, рН 7, 62, до концентрации 108кл/мл и добавляли 5 объемов среды. После осаждения клеток при 300 g в течение 10 мин процедуру очистки повторили (Фримель, 1987).
ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ
Осадок лейкоцитов после выделения и очистки суспендировали в 10 объемах (1 мл) раствора 1, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, рН 7, 0, 0, 5% саркозил и 0, 1 М 2-меркаптоэтанол, при комнатной температуре. Затем добавляли 0, 1 мл 2 М раствора NaAc, рН 4, 0, 1 мл фенола, 0, 2 мл хлороформа и перемешивали. Затем центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин при 4оС, отбирали водную фазу, добавляли к ней равный объем изопропанола и осаждали РНК центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин при 4оС (Chomczynski and Sacchi, 1987).
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
1 г печени стерляди, замороженной в жидком азоте, растирали в тонкий порошок и гомогенизировали в 15 мл раствора, содержащего 0, 5 М Na2ЭДТА, рН 8, 0, 0, 5% саркозила, 100 мкг/мл протеиназы К и нагретого до 65оС. Затем инкубировали при 50оС течение 3 часов при легком покачивании. Затем, избегая резких встряхиваний, экстрагировали ДНК равным объемом фенола три раза, каждый раз разделяя фракции центрифугированием при 4000 g и комнатной температуре. Фенол предварительно очищали перегонкой и насыщали буфером, содержащим 1 М трис-HCl, один раз и два раза буфером, содержащим 0, 1 М трис-HCl и 0, 1% 2-меркаптоэтанол. Диализ ДНК проводили при 10оС в течение 12 часов против 4 л буфера, имеющего состав: 50 мМ трис-HCl, рН 8, 0,
10 мМ Na2ЭДТА,
10 мМ NaCl.
Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы, при 37оС в течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) два раза и проводили диализ при 10оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ Na2ЭДТА, рН 7, 5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др. , 1984).
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Выделение поли(A)+РНК.
Для ингибирования РНКазы все растворы, не содержащие трис, обрабатывали 0, 1% диэтилпирокарбонатом 12 часов при 37оС и автоклавировали. Посуду прокаливали при 250оС в течение 4 часов. Поли(A)+РНК выделяли из суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго(dT)-целлюлозе. Для этого РНК растворяли в воде, прогревали при 65оС в течение 5 мин, добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис-HCl, рН 7, 6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЭДТА, 0, 2% SDS) и трижды пропускали через колонку с олиго(dT)-целлюлозой. Затем промывали колонку 5-10 объемами буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера, содержащего 0, 1 М NaCl. После этого элюировали поли(A)+РНК в 2-3 объемах воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, добавляли 2, 2 объема этанола и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g при 4оС (Маниатис и др. , 1984). Синтез кДНК.
Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene. По матрице поли(A)+РНК синтезировали первую цепь кДНК.
Реакционная имела состав:
5 мкл 10-кратного буфера для синтеза первой цепи,
3 мкл смеси метил-dНTФ,
2 мкл раствора праймер-линкера (1. 4 мкг/мкл),
1 мкл ингибитора РНКазной активности,
1. 5 мкл фермента обратная транскриптаза (50 е. а. /мкл),
вода до суммарного объема 50 мкл.
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1 часа. Затем охлаждали до 0оС и добляли компоненты для синтеза второй цепи кДНК: 20 мкл буфера для синтеза второй цепи,
6 мкл смеси dНTФ,
88, 9 мкл стерильной воды,
2 мкл 32Р-dНTФ (800 Ки/мМ),
2 мкл раствора РНКазыH (1. 5 е. а. /мкл),
11. 1 мкл ДНК полимеразы I.
Смесь инкубировали при 16оС в течение 2, 5 часов, затем охлаждали до 0оС и добавляли компоненты для застройки “липких” концов: 23 мкл смеси дНTФ,
2 мкл Pfu ДНК полимеразы (2, 5 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 72оС в течение 30 мин.
Затем проводили экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) и равным объемом хлороформа, после чего отбирали водную фазу, добавляли 20 мкл 3М NaAc и 400 мкл 96% этанола и осаждали кДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин.
Сшивка молекул кДНК с вектором.
кДНК растворяли с EcoR I адапторами и инкубировали при 4оС в течение 30 мин. Затем добавляли компоненты для сшивки молекул адапторов и молеул кДНК:
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
1 мкл 10 мМ рATФ,
1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т4 (4 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего инактивировали лигазу прогреванием при 70оС в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для фосфорилирования концевых нуклеотидов:
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
2 мкл 10 мМ рATФ,
6 мкл стерильной воды,
1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т4 (10 е. а. /мкл). Реакционную смесь инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для образования липких концов по сайту рестрикции эндонуклеазы Xho I:
28 мкл буфера 4,
3 мкл Xho I (40 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1, 5 часа. Затем добавляли 5 мкл 10-кратного буфера STE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 100 мМ Na2ЭДТА) и пропускали через колонку с гелем сефакрил С-500. Фракции, содержащие молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) и равным объемом хлороформа. Затем добавляли двойной объем этанола, осаждали кДНК центрифугированием, промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Для лигирования брали 5 мкл раствора кДНК (600 нг) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1 мкг), имеющего "липкие" дефосфорилированные концы по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR I и Xho I. Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора рATФ и 1 мкл фермента лигазы фага Т4 (4 е. а. /мкл). Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего экстрагировали равными обьемами фенол-хлороформа и хлороформа.
Амплификация библиотеки.
Электротрансформацию проводили как описано в п. Трансформация прокариотических клеток, после чего высевали 1/1000 объема (2, 5 мкл) среды SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг/мл) для определения количества трансформированных клеток. Остальную часть помещали в 100 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и инкубировали при 37оС при перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет величины D550=2-2, 5. Затем отбирали 1, 6х1011клеток, осаждали их центрифугированием, суспендировали в 4 мл среды LB и перемешивали с 4 мл глицерина. Полученную библиотеку хранили при -70оС.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) содержала следующие компоненты:
100 нг ДНК матрицы,
100 нг невырожденного праймера,
500 нг вырожденного праймера,
5 мкл 2 мМ раствора дНTФ,
5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8, 8, 50 мМ KCl, 1, 5 мМ MgCl2, 0, 001% желатин), 1 мкл Taq полимеразы,
вода до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995). Температурный режим ПЦР.
Реакционную смесь инкубировали при 95оС в течение 5 мин, после чего добавляли Taq полимеразу и использовали температурный режим, при котором в течение первых 18 циклов температуру отжига праймеров понижали на 3оС черех каждые три цикла:
1й-18й циклы 95оС - 1 мин (денатурация ДНК),
50-35оС - 1 мин (отжиг праймеров),
72оС - 2 мин (полимеризация).
19-й-30-й циклы: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 2 мин.
31-й цикл: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 10 мин.
СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК
Фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, разделяли в 1% агарозном геле и выделяли как описано в п. Выделение ДНК из геля. Затем осаждали ДНК этанолом, растворяли в 5-10 мкл воды и добавляли компоненты для удаления выступающих нуклеотидов с 3' конца ДНК:
1 мкл 10-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 8, 2, 100 мМ KСl, 60 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ MgCl2, 1% тритон Х-100 и 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 1 мкл 10 мМ dНTФ,
1 мкл Pfu ДНК полимеразы (2, 5 е. а. /мкл),
воду до конечного объема 10 мкл.
Смесь инкубировали 30 мин при 72оС после чего охлаждали до 0оС и добавляли компоненты для сшивки с вектором pBluescript KS(+) по сайту рестрикции Sma I:
1 мкл расщепленного вектора (0, 5 мкг),
1 мкл 10-кратного буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 7 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ), 1 мкл 10 мМ дATФ,
1 мкл ДНК лигазы фага Т4 и воду до конечного объема 10 мкл. Смесь инкубировали одни сутки при комнатной температуре и затем использовали для химической трансформации клетокE. coli. Трансформированные клетки высевали на селективную среду: 1, 5% LB-агар с ампициллином (50 мкг/мл), тетрациклином (15 мкг/мл), ИПТГ (2 мМ), X-Gal (500 мкг/мл) и инкубировали 14 часов при 37оС. После этого отбирали колонии белого цвета (Маниатис и др. , 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).
СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Библиотеку кДНК высевали на чашки Петри с 1, 5% LB-агаром с ампициллином (50 мкг/мл) из расчета 4000 колоний на чашку и инкубировали при 37оС до тех пор пока колонии не достигнут 0, 5-1 мм в диаметре. Колонии переносили на нейлоновую мембрану и инкубировали при комнатной температуре в денатурирующем растворе (0, 5 М NaOH, 1, 5 М NaCl) в течение 7 мин и два раза по 2 мин в нейтрализующем растворе (1, 5 М NaCl, 0, 5 М трис-HCl, рН 7, 5). Затем споласкивали мембрану в 2-кратном буфере SSC (0, 3 М NaCl, 0, 03 М цитрат натрия), высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм. После этого мембрану помещали в 50 мл предгибридизационного раствора (раствор 1), содержащего:
6-кратный SSC (0. 9 М NaCl, 0, 09 М цитрат натрия),
5-кратный раствор Денхардта (0, 1% бычий сывороточный альбумин, 0, 1% фикол, 0, 1% поливинилпиролидон),
0, 5% SDS,
10% декстран сульфат,
500 мкг денатурирированной ДНК цыпленка,
и инкубировали 1 час при 55оС. После этого добавляли меченую 32P-дATФ ДНК зонда и инкубировали 12-18 часов при 55оС при постоянном покачивании. После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в 200 мл 2-кратного SSC + 0, 1% SDS при комнатной температуре, 15 мин в 1-кратном SSC + 0, 1% SDS% при 55оС и два раза по 10 мин в 0, 1-кратном SSC + 0, 1% SDS при 55оС. Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70оС с рентгеновской пленкой (Маниатис и др. , 1984).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
