Каталаза -- фермент класса оксидоредуктаз, катализирующей разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. При низкой концентрации перекиси каталаза проявляет также пероксидазную активность, окисляя низшие спирты, полифенолы. Биологическая функция каталазы и сводится к защите клеточных мембран от пероксида водорода, образующегося в больших количествах при перекисном окислении липидов (ПОЛ). В контрольной группе беременных отмечалось увеличение активности каталазы во всех трех триместрах беременности. У беременных с гестозом третьей степени по триместрам активность каталазы достоверно снижается. В 1-ом триместре беременности уровень каталазы составил 9,15?0,21x10-4 нмоль/мин?мг; во 2-ом триместре беременности 8,77?0,23x10-4 нмоль/мин?мг; в 3-ем триместре беременности 8,30?0,17x10-4 нмоль/мин?мг. При гестозе второй степени также были выявлены достоверные отличия по сравнению с контролем: 1-ый триместр беременности - 10,00?0,17x10-4 нмоль/мин?мг; 2-ой триместр беременности 9,87?0,13x10-4 нмоль/мин?мг; 3-й триместр беременности - 9,69?0,16x10-4 нмоль/мин?мг. При гестозе первой степени в 1-ом триместре активность составила 11,4?0,14x10-4 нмоль/мин?мг; во 2-ом триместре - 10,8?0,12x10-4 нмоль/мин?мг; в 3-ем триместре - 10,2?0,15x10-4 нмоль/мин?мг. При сравнении форм гестоза 3-ей степени в 3-ем триместре с осложнениями в (7,6?0,18x10-4 нмоль/мин?мг) и без осложнений (8,3?0,17x10-4 нмоль/мин?мг) нами было показано, что активность каталазы зависит не только от степени гестоза, но также от наличия или отсутствия сопутствующей патологии. Наши исследования показали, что в целом при физиологически протекающей беременности с увеличением гестационного срока от первого к третьему триместру метаболическая активность плацентарных макрофагов характеризуется: повышением NO-секреторной активности на 83,6% (p<0,001); падением активности супероксиддисмутазы и каталазы на 64,3% (p<0,001) и 49,4% (p<0,05), соответственно, и падением ферментативной генерации перекиси водорода (табл. 1).
Также, в III триместре выявлено снижение содержания ксантина, гипоксантина и мочевой кислоты на 33%, 18,2% и 28,4% (p<0,05), соответственно, достоверное снижение активности аргиназы на 26,9% (p<0,05) и содержания спермидина и агматина на 46% и 51% (p<0,05), соответственно, возрастание активности СОД в 10,5 раз (p<0,01), глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы на 52,7% и 117,6% (p<0,01), соответственно (табл. 2, 3). (ШЕСТОПАЛОВ АЛЕКСАНДР ВЯЧЕСЛАВОВИЧ МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПЛАЦЕНТАРНЫХ МАКРОФАГОВ И МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПЛАЦЕНТЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ВАРИАНТАХ ТЕЧЕНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук)
1. Активность СОД в сыворотке крови во II-III триместрах неосложненной беременности выше 5,1 Ед/мл позволяет прогнозировать развитие гестоза в 68,2% случаев [Бандик В. П., Чернокульский С.Т, Яроцкий М. Е., Венцковский Б. М. Ультраструктурные особенности микрососудистого русла терминальных ворсин хориона и плацентарный барьер при поздних токсикозах беременности // ПАГ.-- 1994.-- № 2.-- С. 60-61.].
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
Активность ферментов определяли в плацентарной ткани, полученной сразу после родов при соблюдении холодового режима. Ткани взвешивали, навески гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Для определения активности КПН, ФМСФ-КП при гомогенизировании использовали 10 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 5,6), содержащий 50 мМ NaCl, в соотношении 1:50 (вес:объем), каталазы - , в соотношении 1:5, церулоплазмина - , в соотношении 1:5. В работе использовали реактивы: ацетат натрия («MERCK», Германия), ФМСФ («Serva», США), ГЭМЯК (любезно предоставлена доктором О.Л. Варламовым), субстраты - дансил-фен-ала-арг, дансил-фен-лей-арг, синтезированные к.х.н. В.Н. Калихевичем. Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией «ХЧ» и «ОСЧ».
2.1.1. Клинические группы
Было обследовано 19 образцов плацентарной ткани женщин в возрасте от 20 до 35 лет. Родильницы были разделены на 2 клинические группы. В І группу (контрольную) вошли женщины с физиологическим течением беременности и родов. У всех женщин беременность закончилась срочными родами (срок родов колебался от 38 до 40 недель). Околоплодные воды были светлые. Все дети родились в удовлетворительном состоянии со средней оценкой по шкале Апгар на 1-й минуте - 8,2, на 5-й минуте жизни - 8,6. При гистологическом исследовании последов отмечены умеренно-выраженные компенсаторно-приспособительные процессы.
?? группу составили пациентки с ОПГ-гестозом легкой степени тяжести. У всех женщин беременность закончилась срочными родами (срок родов колебался от 38 до 40 недель). Околоплодные воды были светлые. Средняя оценка новорожденных по шкале Апгар на 1-й минуте составила - 8,2, на 5-й минуте жизни - 8,4.
Диагноз поставлен на основании клинических проявлений, клинико-лабораторных данных; оценку степени тяжести гестоза проводили по унифицированной шкале Гоека-Савельевой. При гистологическом исследовании последов в данной группе обнаружены умеренно-выраженные компенсаторно-приспособительные процессы, в некоторых случаях отмечены очаговые нарушения микроциркуляции, инволютивно-дистрофические изменения, признаки инфекции.
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод определения активности основных карбоксипептидаз
Активность КПН определяли флюорометрическим методом Fricker и Snyder [153].
Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37?С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37?С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37?С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.
Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин.
Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 при ?ex=360 нм и ?em=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.
Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Для определения активности ФМСФ-ингибируемой КП 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мМ ингибитора ФМСФ, приготовленного на этаноле, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером (в случае контрольной пробы). Пробы преинкубировали 8 мин при 37?С, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37?С 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH. Активность фермента определяли как разницу в приросте флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.
Концентрацию белка оп-ределяли методом Лоури [80].
2.2.2 Метод определения каталазы
В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое кипятили 2 - 3 мин. В обе вносили по 2 мл 1% H2O2 и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 5 мл 10% H2SO4 и оттитровывали содержимое 0,05н KMnO4 до розового цвета.
Расчет: 1мл 0,05 н KMnO4 -- 0,85 г H2O2. Таким образом, разницу в результатах титрования контроля и опыта умножаем на эту величину, получали количество мг перекиси.
2.2.3 Метод определения активности церулоплазмина
Активность церулоплазмина определяли модифицированным методом Ревина, который базируется на окислении p-фенилендиамина при участии этого фермента. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности образующихся продуктов судят о концентрации церулоплазмина.
В обычные химические пробирки вносили по 0,1 мл гомогената. В одну из пробирок, служащую контрольной, добавляли 2 мл раствора фтористого натрия (с целью инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем во все пробирки помещали по 8 мл ацетатного буфера и по 1 мл раствора p-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивали и ставили на 1ч в водяную баню с температурой +37?С. После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной, доливали по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивали и переносили в холодильник, где выдерживали в течение 30 мин при +4?С. Пробы колориметрировали на ФЭКе с зеленым светофильтром (530нм) в кюветах с шириной слоя 10 мм. Результаты сравнивали с данными контрольной пробы (бледно-розовая окраска). Умножали значения оптической плотности на коэффициент пересчета 875, получали величину концентрации церулоплазмина в мг/л.
2.2.4. Метод определения уровня продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых конъюгатов)
Для экстракции липидов брали 1 мл 25% гомогената плацентарной ткани, приливали 3 мл метанола, перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 мин, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин. Добавляли 3 мл гексана, вновь тщательно перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 мин и оставляли отстаиваться на 30 мин. После разделения слоев, верхний (метанол-гексановый слой) отбирали в сухую пробирку и использовали для исследований.
Уровень диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм, кетодиенов и сопряженных триенов - при длине волны 278 нм, ненасыщенных липидов - при длине волны 220 нм. Рассчитывали содержание диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (E233/E220 и E278/E220).
2.2.5 Метод определения уровня гидроперекисей
Для приготовления гомогената использовали буфер 0,025 М трис HCl (pH 7,4), содержащий 0,175 М хлорида калия. Гомогенат (25%) по 2 мл помещают в центрифужные пробирки и осаждают белок добавлением 0,2 мл 50%-ного раствора ТХУ.
Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 4000g. 2 лм надосадочной жидкости доводят 96% этанолом до 27 мл. К равным объемам до 27 мл добавляют 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-ного раствора соли Мора в 3%-ной соляной кислоте, пробы интенсивно встряхивают. Точно через 30с приливают 1мл 20%-ного раствора роданистого калия, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля используют пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо НЖ. Изменение оптической плотности проводят в течение 10 мин. после добавления роданистого калия при 480 нм.
2.2.6 Статистическая обработка результатов исследования
Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью программы Statgraphics (версия 3.0) (“STSC, Inc.” США) в режимах Simple Correlation.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Активность КПН и ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы в плацентарной ткани в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести
Результаты исследования показали достоверное снижение активности КПH и ФМСФ-КП в плацентарной ткани при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в 2 раза по сравнению с нормой (рисунок 1, 2).
Рисунок 1. Активность карбоксипептидазы H в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести (нмоль продукта, образовавшегося за 1мин инкубации на 1мг белка; M±m; *** - p<0,001 относительно нормы)
По данным корреляционного анализа выявлена положительная взаимосвязь между активностью КПН и ФМСФ-КП в плацентарной ткани. Уменьшение активности КПH согласуется с данными литературы о снижении концентрации белковых гормонов в фетоплацентарном комплексе (ФПК) при ОПГ-гестозах [7,8,9,11,12,13]. Наиболее важными из них являются хорионический гонадотропин, плацентарный лактоген, пролактин, инсулин, инсулиноподобные факторы роста, C - пептид и др.
Рисунок 2. Активность ФМСФ-КП в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести (нмоль продукта, образовавшегося за 1мин инкубации на 1мг белка; M±m; *** - p<0,001 относительно нормы)
По данным корреляционного анализа выявлена положительная взаимосвязь между активностью КПН и ФМСФ-КП в плацентарной ткани. Учитывая, что КПH ассоциирована с процессингом пептидных гормонов [5,16], можно предположить участие фермента в образовании выше указанных биологически активных веществ.
Гестоз является стрессом для ФПК. В условиях патологии отмечено повышение уровней кортикотропин-рилизинг-фактор (КТРФ) и опиоидов в плацентарной ткани [5,8,9,10]. КТРФ, в свою очередь, снижает уровень хорионического гонадотропина, что ведет к угнетению синтеза прогестерона и эстрогенов, которые обладают антиоксидантной активностью. Это усугубляет негативное действие ПО липидов и белков на клеточные мембраны, что может приводить к снижению активности КПH и ФМСФ-КП.
Обнаруженная положительная корреляция между активностью КПН и ФМСФ-КП (r (коэффициент корреляции)=0,9255***) позволяет предположить участие ФМСФ-КП в процессинге регуляторных пептидов в плацентарной ткани.
Таким образом, КПH и ФМСФ-КП плаценты играют важную роль в патогенезе ОПГ-гестоза. Возможно, полученные результаты могут быть основой для дальнейшего исследования гомеостаза ФПК и изыскания способов коррекции метаболических изменений в плаценте при патологическом течении беременности.
3.2 Исследование активности антиоксидантной системы и показателей перекисного окисления липидов в плацентарной ткани в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести
Результаты исследования показали достоверное снижение активности каталазы и церулоплазмина в плацентарной ткани при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в 1,2 раза по сравнению с нормой (рисунок 3).
Рисунок 3. Активность каталазы в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (** - p<0,01 относительно нормы).
Рисунок 4. Активность церулоплазмина в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (* - p<0,05 относительно нормы).
Снижение активности этих ферментов можно объяснить начавшимся угнетением антиоксидантной системы фетоплацентарного комплекса в условиях осложненной беременности.
По данным корреляционного анализа обнаружена положительная взаимосвязь активности церулоплазмина с активностью КПH в плацентарной ткани (r=0,4749*).
Результаты исследования показали достоверное повышение уровня гидроперекисей липидов, а также достоверное снижение концентрации диеновых и триеновых коньюгатов в плацентарной ткани при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести.
Рисунок 5. Концентрация гидроперекисей в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (*-p<0,05 относительно нормы).
Рисунок 6. Активность диеновых коньюгатов в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (*-p<0,05 относительно нормы).
Рисунок 7. Активность триеновых коньюгатов в норме и при ОПГ-гестозе легкой степени тяжести в плацентарной ткани (*-p<0,01 относительно нормы).
По данным корреляционного анализа обнаружены взаимосвязи уровня триеновых коньюгатов с активностью КПН (r=0,6**) и ФМСФ-КП (r=0,5778 **). В патогенезе ОПГ-гестозов ведущую роль играет нарушение структурно-функциональных свойств клеточных мембран плаценты. В условиях патологии усиливается перекисное окисление липидов (ПОЛ) и белков на фоне снижения активности антиоксидантной системы, что является причиной повреждения мембран [6,7,8,9,10,11,12,13].
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ОПГ - гестоз (отек, протеинурия, гипертензия) - это осложнение беременности, обусловленное несоответствием возможностей адаптивных систем организма матери и потребностей развивающегося плода.
Несмотря на многочисленные исследования, проблема гестозов (преэклампсия, гипертония, индуцированная беременностью) остается актуальной. Частота их составляет 8-16%. Они занимают 2-3 место в структуре материнской смертности, являясь одновременно основной причиной неблагоприятных перинатальных исходов. При этом материнская смертность достигает 3,5%, а перинатальная -- 79% [2,6,7].
