Антиоксидантная система при внутриутробной гипоксии плода
p align="left">Таким образом, большинство аминопептидаз участвует в обмене вазоактивных пептидов. Вероятно, эти ферменты препятствуют сужению плацентарных сосудов и вовлекаются в перераспределение фето-плацентарного кровотока при ХВГП.

В микроворсинках плацентарного синцитиотрофобласта в большом количестве содержится ангиотензинпревращающий фермент - компонент ренин-ангиотензиновой системы (РАС). Фермент катализирует превращение ангиотензина I в ангиотензин II, участвует в деградации брадикинина. Показано, что в норме содержание фермента в плазме крови беременных постоянно нарастает к III триместру [16].

Также в микроворсинках плаценты человека обнаружена карбоксипептидаза N. Фермент, являясь компонентом калликреин-кининовой системы (ККС), главным образом контролирует циркуляцию крови в фетоплацентарном комплексе, участвует в деградации брадикинина в плаценте и сыворотке крови. Обнаружено, что уровни брадикинина в артериальной и венозной крови сосудов пуповины ниже, чем в крови матери [38].

Многообразные функции в плацентарной ткани выполняют пептидгидролазы. Определенную роль в развитии беременности, особенно в ранние сроки, в период имплантации плодного яйца, играют катепсины, активность которых прогрессивно снижается в процессе развития беременности, особенно при перенашивании.

Таким образом, при осложнениях беременности отмечаются изменения в функционировании ферментных систем плаценты, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации пептидов, регулирующих кровоток в ФПК. Последние, в свою очередь, могут быть вовлечены в развитие многочисленных адаптационных реакций. Поэтому представляется важным исследование активности ферментов обмена биологических активных пептидов при патологиях беременности.

1.3.1. Катепсины

Катепсины - (от греч. kathepso-перевариваю), ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз пептидной связи. Содержатся в тканях животных и человека. Неспецифический протеолиз играет важную роль в регуляции белкового обмена, в ходе которого белки организма постоянно обновляются.

По строению активного центра различают три основных группы катепсинов. В группу катепсинов, содержащих в активном центре остаток серина (так называемые сериновые амидгидролазы), входят катепсин А (сериновая карбоксипептидаза A1)и катепсин G. Обширную группу составляют катепсины, содержащие в активном центре цистеин (тиоловые амидгидролазы). В эту группу входят катепсины В, С, Н, L, N и S. К катепсинам, содержащим в активном центре остаток аспарагиновой кислоты (так называемые карбоксильные амидгидролазы), относятся катепсин D и катепсин Е. Катепсин С обладает также сильно выраженной транспептидазной активностью - катализирует перенос олигопептидов на пептиды или аминокислоты. Известен также катепсин F, который катализирует расщепление протеогликанов. Он ингибируется некоторыми иммуноглобулинами, не чувствителен к действию диизопропилфторфосфата, пепстатина и реагентов, взаимодействующих с группой SH [16, 38].

Во время беременности наблюдается активация протеолиза. В I триместре повышение протеолитической активности может быть связано с происходящими в этот период процессами имплантации и плацентации. II триместр характеризуется завершением периода формирования плаценты и вступлением ее в фазу активного функционирования, что обеспечивает иммуносупрессию. В III триместре увеличение активности ингибиторного звена протеолитической системы может быть связано с нарастанием потенциала свертывания крови, гиперкоагуляцией. Перед родами активация протеолиза связана с повышением фибринолитической активности трофобласта. После родов наблюдается усиление активности ингибиторов протеаз, что может быть расценено как защитная компенсаторная реакция [16].

Катепсин D - важнейшая лизосомальная протеиназа, отражающая способность клеток к ращеплению белков и играющая важную роль в процессе внутриклеточного протеолиза.

Катепсин D существует в виде множественных форм с pI от 5,8 до 7,2 [14, 16]. Максимальная активность отмечена при pH 2,8-4,0.

При гель-фильтрации установлена Mr 42000, а при аналитическом ультрацентрифугировании - 43300. В плаценте протеиназа локализована в ворсинах синцитиотрофобласта.

Катепсин D - эндопептидаза, гидролизующая пептидные связи, образованные остатками гидрофобных аминокислот, один из которых - ароматический. Лучшим субстратом является гемоглобин. Фермент раcщепляет многие природные субстраты: вещество Р, соматостатин, пролактин , -липотропин, -эндорфин.

Катепсин D участвует в регуляции развития клетки и ее программируемой гибели, что связано с процессами в системе протеолиз-антипротеолиз, в которой происходит нарушение баланса при ХВГП. Поэтому представляет интерес изучение активности катепсина D при патологическом течении беременности.

1.4. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная система фетоплацентарного комплекса при физиологической беременности и хронической внутриутробной гипоксии плода

При физиологической беременности скорость инициированного окисления липидов повышается примерно в 3 раза. Во время беременности в связи с возрастанием основного обмена и увеличением потребления кислорода в крови происходит ряд значительных биохимических изменений: повышается концентрация нейтрального жира, холестерина и липидов [3]. Также увеличивается активность фосфолипазы А2. В результате ее действия в крови увеличивается концентрация ненасыщенных жирных кислот, которые являются непосредственным субстратом для перекисного окисления [15]. Нарушения в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной активности (АОА) являются одним из механизмов формирования антиоксидантной недостаточности вследствие чрезмерного усиления ПОЛ. В результате активации ПОЛ и накопления свободных радикалов происходит нарушение структурно-функциональной целостности клеточных мембран, освобождение лизосомальных ферментов, что в конечном итоге приводит к патологическим процессам в клетке и организме в целом [2, 3, 33]. В настоящее время можно считать в основном расшифрованными механизмы альтерации и реакцию клеточных мембран на повреждение. В конечном итоге они обусловлены свободно-радикальной агрессией и процессами перекисного окисления липидов и белков - важнейших компонентов клеточной стенки [4]. Активатором перекисного окисления служат свободнорадикальные формы кислорода. Субстратом ПОЛ являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК). Дефицит ПНЖК нарушает барьерную и матричную функции клеточных мембран. Об этом свидетельствует повышение параметра упорядоченности липидного бислоя мембраны (микровязкости мембран) [37]. Одновременно с этим отмечено выраженное уменьшение гидрофобности мембран, а, следовательно, увеличение гидрофилии липидного бислоя, и как следствие - его повышенную проницаемость. Нарушение барьерной функции липидного бислоя мембран сопряжено с изменением функционирования каналов для ионов, в первую очередь Са2+, а также - Na+, K+, Mg2+. Массивный вход Са2+ в клетку приводит к необратимым изменениям в ней, в частности к энергетическому голоду и ее гибели, с одной стороны, а с другой - дополнительно к мышечной контрактуре и вазоспазму. Диеновые коньюгаты, являющиеся первичным продуктом перекисного окисления, увеличивают полярность гидрофобных углеводородных хвостов жирных кислот, которые образуют липидный бислой мембраны. При физиологическом процессе регуляции клеточной активности участки углеводородных хвостов, полярность которых возросла, вытесняются из глубоких слоев мембраны к поверхности, что облегчает процесс самообновления мембраны и влияет на ее проницаемость и ионный транспорт. При избыточном появлении свободнорадикальных форм кислорода самоускоряющееся ПОЛ приводит к полному разрушению ненасыщенных липидов, нарушению структуры и функции белков и других молекул и, как следствие, к гибели клетки [3, 15].

Одним из основных способов неспецифической защиты жизнеспособности органов и тканей является активность антиоксидантных систем, обеспечивающих устойчивость живых клеток к свободнорадикальному повреждению [15, 24]. Исследования последних лет подтвердили, что у женщин с ХВГП напряженность оксидантного стресса, регистрируемая по динамике плазменного уровня общей оксидантной активности, концентрации перекисных липидов и малонового диальдегида (МДА), прогрессивно нарастает к концу 3-го триместра беременности [3, 5, 33].

В АО различают ферментативные (оксидоредуктазные ферменты и антиперекисные ферменты) и неферментативные (низкомолекулярные тиолы, аскорбиновая кислота, токоферол, витамины А, К, Р, убихинон и др.) звенья. Защита структурных биологических мембран осуществляется преимущественно липидными биоантиоксидантами. Активность антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы в эритроцитах существенно не изменена как при физиологической беременности, так и при риске невынашивания в обоих критических сроках. Активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в ранних сроках беременности повышается значительно. Одновременно уровень токоферола и ретинола снижается в плазме и повышается в плацентарной ткани. [33]. Важными ферментами АОС являются каталаза и церулоплазмин. Церулоплазмин (ЦП) -- медьсодержащая оксидаза, относится к альфа-2-глобулиновой фракции плазмы крови человека. Особый интерес вызывают антиоксидантные, иммунорегулирующие, радиопротективные свойства. Благодаря своей высокой ферроксидазной активности ЦП предотвращает неферментативные реакции, дающие начало свободным радикалам и дальнейшему развитию ПОЛ. При физиологических условиях ЦП крови ингибирует ПОЛ на 50%. Подавление ПОЛ достигается за счет перехвата и инактивации супероксидного ион-радикала О2 * [3, 5].

Выявлено увеличение концентрации ЦП у беременных в сравнении с их значениями у небеременных [27, 34]. По-видимому, данный факт объясняется активацией системы ПОЛ при беременности, приводящей в свою очередь к активации антиоксидантной системы защиты организма. Кроме того, выявлено достоверное снижение активности ЦП при ХВГП и гестозах, что может быть объяснено истощением антиоксидантной системы защиты организма в условиях ее напряженного функционирования, вызванного развитием тяжелых осложнений беременности [27, 29, 34, 44].

Каталаза -- фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий разложение перекиси водорода на воду и молекулярный кислород. При низкой концентрации перекиси каталаза проявляет также пероксидазную активность, окисляя низшие спирты, полифенолы. Одной из основных функций каталазы является защита клеточных мембран от пероксида водорода, образующегося при перекисном окислении липидов [29].

Таким образом, при патологически протекающей беременности наблюдается дисбаланс в системе ПОЛ-АОС. При активации свободно-радикальных процессов на фоне снижения антиоксидантной активности риску повышенной окислительной модификации подвергаются не только липиды, но и белки. В связи с этим вызывает интерес изучение показателей перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы в плаценте при ХВГП.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

Активность катепсина D, содержание пептидов средней молекулярной массы, активность каталазы, церулоплазмина, уровень продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых коньюгатов), уровень гидроперекисей определяли в плацентарной ткани, которую получили сразу после родов. Для исследования брали наиболее удаленную от места прикрепления пуповины ткань. Плацентарную ткань помещали в охлажденный физиологический раствор, очищали от крови и высушивали фильтровальной бумагой. Ткани взвешивали, навески гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком.

2.1.1. Клинические группы

Было обследовано 16 образцов плацентарной ткани женщин в возрасте от 20 до 40 лет.

Все родильницы были разделены на 2 группы (рис. 1). Первая группа - женщины с физиологическим течением беременности и родов (n =8), вторая группа - женщины с хронической внутриутробной гипоксией плода (n=8).

Клинические группы

20

норма ХВГП

Рис. 1. Клинические группы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Метод определения активности катепсина D

Для определения активности катепсина D использовали 7,5%-ый гомогенат ткани на натрий-ацетатном буфере (рН 3,3). Препарат фермента (20 мкл) смешивали с 60 мкл 100 мМ натрий-ацетатного буфера (рН 3,3) и преинкубировали 8 мин при температуре 37°С. Начинали реакцию прибавлением в опытные пробы 20 мкл 8% раствора гемоглобина, полученного из бычьей крови. Реакцию останавливали через 40 мин прибавлением 100 мкл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. В контрольные пробы добавляли 20 мкл 8% раствора гемоглобина. Пробы центрифугировали 30 мин при 4000 об/мин. После центрифугирования отбирали 100 мкл надосадочной жидкости и определяли количество образовавшегося тирозина методом Лоури. Пробы колориметрировали на КФК-2 при л=750 нм. Активность фермента определяли как разность в оптической плотности между опытными и контрольными пробами. Активность фермента выражали в нмоль тир, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка. Количество белка в пробах определяли методом Лоури.

2.2.2. Метод определения количества пептидов средней молекулярной массы

Для определения количества пептидов средней молекулярной массы использовали 5%-ый гомогенат ткани. Белки исследуемой биологической жидкости осаждали равным объемом 0,6 М раствора хлорной кислоты. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость нейтрализовали 3М раствором К2СО3 из расчета 0,2 мл на 1 мл супернатанта. Осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Нейтрализованный супернатант разводили в 5 раз. После центрифугирования отбирали 0,5 мл нейтрализованного разведенного супернатанта, в котором определяли количество пептидов средней молекулярной массы методом Лоури. Содержание пептидов средней молекулярной массы выражали в мкг/мл.

2.2.3. Метод определения активности каталазы

Активность каталазы выражается каталазным числом - количеством мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкг крови (гомогената).

В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое контрольной пробы кипятили 2 - 3 мин. В обе колбы вносили по 2 мл 1% раствора H2O2 и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 5 мл 10% H2SO4 и оттитровывали содержимое колб 0,05н раствором KMnO4 до розового цвета.

Расчет: 1мл 0,05 н KMnO4 соответствует 0,85 г H2O2. Таким образом, разницу в результатах титрования контроля и опыта умножаем на эту величину и получаем количество мг перекиси водорода, которое может разложить 1 мкл гомогената.

2.2.4. Метод определения активности церулоплазмина

Активность церулоплазмина определяли модифицированным методом Ревина, который базируется на окислении p-фенилендиамина при участии этого фермента. Ферментативную реакцию останавливают добавлением фтористого натрия. По оптической плотности образующихся продуктов судят о концентрации церулоплазмина.

В пробирки вносили по 0,1 мл гомогената. В контрольную пробу добавляли 2 мл раствора NaF (с целью инактивации ферментативной активности церулоплазмина). Затем в контроль и опыт добавляли по 8 мл ацетатного буфера и по 1 мл р-фенилендиамина (используемого в качестве субстрата). Пробирки встряхивали и инкубировали 1 час при температуре, равной +370С.

После инкубации во все пробирки, за исключением контрольной, доливали по 2 мл раствора фтористого натрия. Содержимое пробирок перемешивали и переносили в холодильник, где выдерживали в течение 30 минут при +40С.

Пробы колориметрировали на КФК-2 при л=530 нм. Результаты сравнивали с данными контрольной пробы. Значение оптической плотности умножали на коэффициент пересчета 875.

2.2.5. Метод определения содержания продуктов перекисного окисления липидов (диеновых и триеновых коньюгатов)

Для экстракции липидов брали 1 мл 25% гомогената плацентарной ткани, приливали 3 мл метанола, перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 минут, затем центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут. Добавляли 3 мл гексана, вновь тщательно перемешивали стеклянной палочкой, встряхивали в течение 15 минут и оставляли отстаиваться на 30 минут.

После разделения слоев, верхний (метанол - гексановый слой) отбирали в сухую пробирку и использовали для исследований.

Уровень диеновых конъюгатов определяли спектрофотометрически при длине волны 233 нм, кетодиенов и сопряженных триенов - 278 нм, ненасыщенных липидов - 220 нм. Рассчитывали содержанимое диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряженных триенов по отношению к уровню ненасыщенных липидов (E233/E220 и Е278/Е220).

2.2.6. Метод определения содержания гидроперекисей

Для приготовления гомогената использовали буфер 0,025 н трис-HCl (pH 7,4), содержащий 0,175 м KCl. В центрифужные пробирки помещали по 2 мл 25% гомогената и осаждали белки добавлением 0,2 мл 50% раствора ТХУ.

Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течении 10 минут при 4000 об/мин. Далее 2 мл надосадочной жидкости доводили 96% этанолом до 27 мл, прибавляли 0,2 мл концентрированной соляной кислоты и 0,025 мл 5%-го раствора соли Мора в 3%-ной HCl, пробы интенсивно встряхивали. Через 30 секунд приливали 1 мл 20%-го раствора роданистого калия, после чего развивается малиновая окраска. В качестве контроля использовали пробы, содержащие 96%-ный этанол вместо надосадочной жидкости. Измерение оптической плотности проводили в течение 10 минут после добавления роданистого калия при л=480 нм.

2.2.7. Статистическая обработка результатов исследования

Достоверность отличий между средними определяли с использованием t-критерия Стьюдента. Корреляционный анализ проводили с помощью программы Статистика (версия 6.0).

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Активность катепсина D в плацентарной ткани в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода

Результаты исследования показали достоверное повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода. Отмечено повышение активности фермента при патологии в 1,8 раз по сравнению с нормой (рис.2).

Рис.2. Активность катепсина D в плаценте в норме и при хронической внутриутробной гипоксии плода (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин инкубации на 1 мг белка; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 относительно нормы)

Повышение активности катепсина D плацентарной ткани при хронической внутриутробной гипоксии плода может быть связано с нарушением структурно-функциональных свойств клеточных мембран плаценты при изучаемой патологии.

Страницы: 1, 2, 3



Реклама
В соцсетях
рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать