Эктоинсинтаза была очищена до гомогенного состояния в присутствии 1 мМ ДАБ и 2 М NaCl в качестве стабилизаторов. Фермент является гомодимером с молекулярной массой субъединицы 19 кДа, но в буфере с высокой осмолярностью (0.5 М NaCl), использовавшемся при гель-фильтрации, активность фермента не найдена. Поэтому неясно, действительно ли нативная эктоинсинтаза имеет молекулярную массу 35 кДа и является гомодимером, или имела место неспецифическая агрегация мономеров в присутствии высокой концентрации соли. Анализ аминокислотного состава эктоинсинтазы выявил повышенное содержание L-аспартата и L-глутамина. Фермент весьма специфичен к AДAБ, по-видимому, N-ацетильная группа в -положении не участвует в циклизации молекулы. Изоэлектрическая точка фермента (рI) составила 4.2 - 4.4. Предполагается, что лимитирующим звеном биосинтетической последовательности эктоина является синтез ДАБ с участием ДАБ-аминотрансферазы. Это подтверждает факт отсутствия ДАБ в клетках H. elongata KS3 (Ono et al., 1998).
Все три фермента пути синтеза эктоина у H. elongatа имеют близкие параметры для проявления максимальной активности: рН 8.2 - 9.0, t = 15 - 20?С и 0.4 - 0.5 М NaCl. Тем не менее, ДАБ-аминотрансфераза более активна в присутствии 0.01 - 0.5 М KCl, чем при тех же концентрациях NaCl (Ono et al., 1999). Оптимальные концентрации соли для активности трёх ферментов ниже, чем предполагалось исходя из галотолерантности H. elongata DSM2581, что, очевидно, связано с относительно низкой внутриклеточной концентрацией свободных ионов. Так, внутриклеточный уровень Na+ в клетках галофильных эубактерий Vibrio costicola и Brevibacterium sp., растущих в присутствии высокой концентрации NaCl, составлял 0.04 - 0.2 М (Gilboa et al., 1991; Nagata et al., 1995).
Недавно эктоингидроксилаза была очищена из Salibacillus salexigens и частично охарактеризована (Bursy et al., 2007). Фермент представляет собой мономер (М.м. 34 кДа) с оптимумами рН и температуры 7.5 и 32°C, соответственно. Эктоингидроксилаза S. salexigens является 2-оксоглутарат-зависимым ферментом и требует присутствия молекулярного кислорода в реакционной смеси. В активный центр эктоингидроксилазы входит одна молекула Fe(II), поэтому авторы отнесли данный белок к суперсемейству негемсодержащих Fe(II)- и 2-оксоглутарат-зависимых диоксигеназ (EC 1.14.11). Максимальная активность фермента составила 13.8 Е/мг, Kм для эктоина и 2-оксоглутарата составили 3.5 ± 0.2 и 5.2 ± 0.2 мM, соответственно (Bursy et al., 2007).
Глава 3 Осмоадаптация аэробных метилотрофных бактерий
Аэробные метилотрофные бактерии используют метан (метанотрофы), его окисленные или замещенные производные (метилобактерии) в качестве источников углерода и энергии. Большинство коллекционных культур метанотрофов до конца 80-х годов были представлены нейтрофильными негалофильными штаммами, растущими при pH 6.5-7.5 и низкой солености (менее 0.5% NaCl). Исключение составляли морские метанотрофы, растущие при солености до 3% NaCl (Гальченко и др., 1986).
Первый солезависимый метанотроф Methylomicrobium pelagicum был выделен из Саргассова моря (Sieburth et al., 1987), но вскоре утерян, позднее, из образцов ила щелочных озер Тувы удалось выделить галотолерантный алкалофильный метанотроф Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, оптимально растущий при рН 9.0 в присутствии 4% NaCl с верхней границей галотолерантности при 9% NaCl (Хмеленина и др., 1996). Из гиперсоленого (14% NaCl) озера Сасык-Сиваш был выделен умеренно галофильный нейтрофильный метанотроф Methylomicrobium modestohalophilum 10S, растущий при pH 5.5-8.5 и солености от 0.2 до 9% (Калюжная и др., 1998), а также Methylohalobius crimeensis, устойчивый к 15% NaCl (Heyer et al., 2005), из содовых озер Южного Забайкалья были выделены пять штаммов облигатных метанотрофов Methylomicrobium buryatense, которые являются алкалотолерантыми галофилами (штаммы 4G, 5G и 6G) или галотолерантными факультативными алкалофилами (штаммы 7G и 5B) (Калюжная и др., 1999; Kalyuzhnaya et al., 2001; 2008).
Первые галофильные метилобактерии были выделены из морских проб и представлены видами рода Methylophaga: М. marina, M. thalassica (Janvier et al., 1985), M. sulfidovorans (de Zwart et al., 1996), M. limanica (Доронина и др., 1997). Методом in situ гибридизации было показано широкое распространение бактерий рода Methylophaga в морских образцах (Janvier et al., 2003). Из лимана Азовского моря и засоленной почвы г. Алушта были выделены в чистые культуры умеренно галофильные метилобактерии, оптимально растущие в присутствии 3-6% NaCl, и рН 7.5-8.5 и классифицированные как виды нового рода Methylarcula: M. marina и M. terricola (Doronina et al., 2000). Из содовых озер Южного Забайкалья и Монголии были также выделены два В12-зависимых изолята метилобактерий, оптимально растущих в присутствии 3-6% NaCl, рН 7.0-11.0 и температуре 25-29°С, идентифицированых как новые алкалофильные виды рода Methylophaga: М. alcalica и M. natronica (Doronina et al, 2003 a,b).
Исследования цитобиохимических особенностей солезависимых метанотрофов и метилобактерий показали, что у них реализуются различные механизмы осмоадаптации. У гало(алкало)фильных метилотрофов при повышении осмолярности измененяется химический состав мембран, в частности, возрастает относительное содержание отрицательно заряженного фосфатидилглицерина и понижение доли ФЭА (Khmelenina et al., 1999). В фосфолипидном пуле клеток метилобактерий в ответ на повышение солености возрастают уровни фосфатидилглицерина и кардиолипина на фоне снижения доли фосфатидилэтаноламина (Троценко и др., 2007). Подобный солезависимый ответ на повышение солености типичен для многих грамотрицательных галофильных и галотолерантных эубактерий (Imhoff and Thiemann, 1991). Известно, что отрицательно заряженный фосфатидилглицерин, а также цвиттерионный фосфатидилхолин обладают стабилизирующим действием на мембраны, формируя мембранный бислой, способствующий избирательной диффузии катионов. Таким образом, у метилотрофов реализуется общий для бактерий «пассивный» механизм поддержания ионного гомеостаза. У солезависимых метанотрофов рода Methylomicrobium, кроме того, выявлены дополнительные поверхностные гликопротеиновые слои (S-слои), полностью покрывающие клеточную стенку бактерий. Придавая клеточному конверту бактерий дополнительную прочность, что особенно актуально в случае изменяющегося осмотического давления среды, эти регулярные поверхностные структуры, возможно, также участвуют в осмоадаптации. Наряду с повышением ригидности клеточных конвертов все изученные солезависимые метилотрофы синтезируют низкомолекулярные осмопротекторные соединения.
Методом ЯМР в клетках исследованных галофильных и галотолерантных метанотрофов и метилобактерий выявлено присутствие эктоина, сахарозы и глутамата (Khmelenina et al., 1999; Троценко и др., 2007). Пул этих соединений увеличивался с повышением солености среды культивирования, причем внутриклеточная концентрация эктоина у Mm. alсaliphilum 20Z достигала 1.4 М, глутамата - 0.4 М в пересчете на внутриклеточную воду. Очевидно, противоионом для глутамата служит К+, поскольку их концентрации в цитоплазме были эквимолярны. Суммарное внутриклеточное содержание всех осмопротекторов у исследованных штаммов полностью уравновешивало осмолярность среды (Doronina et al., 2003 a,b).
Метилобактерии рода Methylophaga при росте на средах с низкими концентрациями NaCl (2-3%) накапливают только глутамат, а при увеличении солености среды до 10-12% основным осмопротектором является эктоин. Кроме того, у M. murata внутриклеточные концентрации глутамата и эктоина возрастали при снижении температуры культивирования.
Установлено, что последовательность реакций биосинтеза эктоина у метилотрофов идентична таковой у галофильных гетеротрофов и начинается реакцией трансаминирования L-аспартилполуальдегида с последующим ацетилированием образующегося L-2,4-диаминобутирата (ДАБ) и завершается циклизацией N-ацетил-L-2,4-ДАБ в эктоин. Эти реакции катализируются ДАБ-ацетилтрансферазой, ДАБ-аминотрансферазой, эктоинсинтазой (Рис.2). Полная нуклеотидная последовательность генов биосинтеза эктоина была определена у Mm. alcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica. Показано, что у данных бактерий гены синтеза эктоина организованы в четырехгенный оперон ectABCask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Reshetnikov et al., 2006; Решетников, 2006). Гены ectABC метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z были амплифицированы и клонированы в плазмиду pHSG575. Клетки E. coli, трансформированные полученной плазмидой, накапливали эктоин и росли в присутствии 4% NaCl, что доказывает участие генов ectABC в биосинтезе эктоина (Reshetnikov et al., 2006).
52
Рис. 2. Путь биосинтеза эктоина и аминокислот аспартатного семейства у бактерий (Louis and Galinski, 1997)
У Mm. аlcaliphilum 20Z, M. alcalica и M. thalassica гены биосинтеза эктоина сцеплены и составляют оперон ectABC-ask, в состав которого входит дополнительный ген аспартаткиназы (ask) (Рис З.). Наличие дополнительного гена ask, возможно, обеспечивает относительно независимый от основного метаболизма контроль синтеза предшественника эктоина - аспартилфосфата (Reshetnikov et al., 2006; Троценко и др., 2007).
Сравнение транслированных аминокислотных последовательностей белков EctА, EctB и EctС показало, что у метанотрофа Mm. alcaliphilum 20Z эти белки имеют большеe сходство с соответствующими белками из метилобактерий M. alcalica и M. thalassica (75-85% гомологии) и низкое сходство (36-63%) с соответствующими ферментами из других галофильных бактерий. Причем ферменты биосинтеза эктоина метилотрофных бактерий формируют единые кластеры на соответствующих филогенетических деревьях, включающих ферменты гетеротрофных галлофилов (Решетников, 2006).
52
Рис. 3. Организация генов биосинтеза эктоина. ectA - ДАБ-ацетилтрансфераза, ectB - ДАБ-аминотрансфераза, ectC - эктоинсинтаза, ectD - эктоингидроксилаза и ask - аспартаткиназа.
Достаточно высокое сходство нуклеотидных последовательностей генов ectА, ectB и ectС позволило выдвинуть гипотезу о высокой консервативности пути биосинтеза эктоина и распространении ect-генов среди бактерий посредством латерального переноса (Kuhlman and Bremer, 2002).
Способ получения эктоина реализован фирмой «Biomol» (Германия) с использованием гетеротрофной бактерии Halomonas elongata на среде с глюкозой, L-аминокислотами и 12%-ным NaCl. Умеренно галофильные метанотрофы при росте на среде с 6% NaCl способны накапливать до 20% эктоина, т.е. выше, чем у гетеротрофных продуцентов, растущих при 12% NaCl (Хмеленина с соавт., 2000; Khmelenina et al., 1999). Это позволяет рассматривать галофильные метилотрофы как потенциальные продуценты эктоина. Причины различий в уровнях осмопротектора могут быть в генетически детерминированных регуляторных механизмах биосинтеза эктоина. Так, синтез эктоина у галофильных метанотрофов происходит через биохимический путь, близкий таковому у гетеротрофных галофильных бактерий (Решетников и др., 2004; Reshetnikov et al., 2006). У Mm. alcaliphilum 20Z организация генов биосинтеза эктоина существенно отличается, поскольку они составляют четырехгенный кластер, включающий дополнительный ген аспартаткиназы. Это предполагает присутствие у облигатного метанотрофа специфической изоформы аспартаткиназы, которая, по-видимому, обеспечивает относительно независимый от основного конструктивного метаболизма синтез предшественников эктоина - аспартилфосфата и аспартилполульдегида.
Из вышеизложенного логически следует необходимость расшифровки полной нуклеотидной последовательности и сравнительное изучение генов синтеза эктоина у M. marina. Это позволит оценить степень дивергенции ect-генов у различных изолятов и проследить эволюцию этого биосинтетического пути. Кроме того, необходимость понимания принципов организации и регуляции генов и ферментов биосинтеза эктоина у аэробных метилотрофов диктуется практическими задачами получения этого биопротектора, все более активно используемого в медицине, косметике и научной практике в качестве водоудерживающего средства, стабилизатора биомолекул и клеток.
Экспериментальная часть
Глава 4 Материалы и методы исследования
4.1 Культивирование бактерий
В работе использовали чистую культуру аэробной метилотрофной бактерии Methylarcula marina из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН. Methylarcula marina выращивали на среде “K” (табл. 2). Среду и раствор микроэлементов стерилизовали при 1 атм, 30 мин. Непосредственно перед засевом в качестве источника углерода вносили метиламин в конечной концентрации 1%. Культивирование проводили в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл среды. Инокулят добавляли в среду в соотношении 1:10 и встряхивали на роторной качалке (140 об/мин) при 26 °C.
Escherichia coli XL1-Blue, BL21(DE3) или S17-1 (штммы E. coli любезно предоставлены к.б.н. Ивашиной Т.В. ИБФМ РАН) выращивали при 37oС на жидкой или агаризованной (1.5% агара “Difco”) средах “LB” (табл. 2) с разными концентрациями соли (0-5% NaCl) с добавлением при необходимости селективных антибиотиков: канамицина (Km) - 50 мкг/мл, ампициллина (Amp) - 100 мкг/мл или хлорамфеникола (Cm) - 25 мкг/мл.
Таблица 2. Питательные среды, использованные в работе.
Компонент среды | Концентрация | ||
“К” | КН2РО4 (NH4)2SO4 MgSO4?7H2O FeSO4?7H2O NaCl рН доводили до 7.4 Агар* | 2.0 г/л 2.0 г/л 0.025 г/л 0.002 г/л 0.5 г/л 2% | |
“LB” | Бакто-триптон Дрожжевой экстракт NaCl КСl MgCl2?6H2O МgSO4?7H2O Глюкоза | 20 г/л 5 г/л 0.584 г/л 0.186 г/л 2.03 г/л 2.463 г/л 3.6 г/л |
4.2 Получение бесклеточных экстрактов и определение концентрации белка
Клетки в экспоненциальной фазе роста центрифугировали (30 мин при 6000 об/мин), дважды отмывали в буфере А (100 мМ трис-НCl, рН 8.0, содержащий 2.5 мМ MgCl2 и 1.5% KCl) и ресуспендировали в том же буфере. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (Англия) мощностью 150 Вт при 20 Гц (3?1 мин с минутными перерывами) при охлаждении. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 4oС (14000 об/мин в течение 30 мин).
Концентрацию белка определяли модифицированным методом Лоури (Schacterle, Pollack, 1973) с использованием БСА в качестве стандарта.
4.3 Определение активности диаминобутиратацетилтрансферазы
Диаминобутиратацетилтрансферазу (ДАБАцТ) (НФ 2.3.1.-). Активность фермента определяли при 20°С по образованию 5-тио-2-нитробензойной кислоты (е412 = 13,6 мМ-1 ?см-1) в результате взаимодействия 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) (ДТНБ) с сульфгидрильными группами КоASH, образующимися в ходе реакции (Srere, 1969). Реакционная смесь (1 мл) содержала (мкмоль): Тris-HCl буфер - 100, рН 8.0, ДТНБ -0.1, ацетил-КоА - 1, КCl - 200 и L-2,4-диаминобутират (ДАБ) - 10. За единицу активности (Е) ДАБАцТ принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль КoASH за 1 мин. Активность фермента определяли на регистрирующем спектрофотометре “Shimadzu UV-160” (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 10 мм. Активность фермента выражали как число наномолей образованой 5-тио-2-нитробензойной кислоты на 1 мг белка в мин.
4.4 Выделение и анализ осмопротекторов
Низкомолекулярные органические соединения экстрагировали из клеток, выросших при разной солёности среды (0 - 8% NaCl). 100-200 мг клеток (вес сырой биомассы) ресуспендировали в 2 мл метанола, выдерживали 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатанты высушивали в вакуумном испарителе, ресуспендировали в 0.5 мл 0.01 М раствора малеиновой кислоты в D2О (или в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ) и анализировали методом протонного резонанса, используя ЯМР-спектрометр высокого разрешения WP 80SY (“Bruker Spectrospin”, Швейцария) с рабочей частотой 80 Мгц. Содержание внутриклеточных метаболитов в образцах определяли сравнением интенсивности сигналов протонов метаболитов с интенсивностью сигналов протонов малеиновой кислоты как внутреннего количественного стандарта (Khmelenina et al., 1999).
Экстракция и количественное определение эктоина. Эктоин экстрагировали из клеток, выросших без соли (Methylobacterium extorquens) и при разной солёности среды (0 - 8% NaCl), когда анализировали накопление эктоина у Methylarcula marina. 100-200 мг клеток (вес сырой биомассы) ресуспендировали в 2 мл метанола, выдерживали 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин. Супернатанты высушивали в вакуумном испарителе, ресуспендировали в дионизованной воде, для анализа на ВЭЖХ. Для количественного определения эктоина использовали модифицированный метод ВЭЖХ (Kuhlmann and Bremer, 2002). 20 мкл водного раствора образца наносили на колонку SGX NH2 (3?150 мм, 5мкм; Чехия) и элюировали 80% ацетонитрилом (вода/ацетонитрил) со скоростью 1мл/мин. Регистрацию пиков проводили на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США) при 190 нм. В качестве стандарта использовали эктоин фирмы “Sigma”.
4.5 Молекулярно-биологические методы
Выделение геномной ДНК
Очистку хромосомной ДНК проводили модифицированным методом (Marmur, 1961). 1 г сырых клеток ресуспендировали в 9 мл TE-буфера (табл.3). К суспензии добавляли лизоцим до конечной концентрации 1 мг/мл. Тщательно перемешивали и инкубировали 30 мин при 37 °С. Затем добавляли 50 мкл протеиназы К (концентрация 20 мг/мл) и инкубировали 30 мин при 37 °С. К суспензии добавляли 250 мкл 20% раствора додецилсульфат натрия (SDS) и инкубировали 60 мин при 65 °С. Далее к раствору добавляли 1.8 мл 5М NaCl и 1.5 мл 10% цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) в 0.7 М NaCl. Лизат выдерживали 20 мин при 65 оС.
В лизат добавляли равный объем хлороформа (используется смесь хлороформа и изоамилового спирта - 24:1). Тщательно перемешивали и центрифугировали при 10000 об/мин, 15 мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Добавляли равный объем фенола, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали для разделения фаз. Верхнюю фазу, не затрагивая интерфазы, переносили в новую пробирку. К раствору добавляли равный объем смеси фенола и хлороформа, перемешивали, центрифугировали и отбирали верхнюю фазу. Добавляли равный объем хлороформа, раствор перемешивали и центрифугировали 15 мин при 10000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку и добавляли равный объем хлороформа, перемешивали и центрифугировали. Экстракцию хлороформом проводили несколько раз до просветления верхней фазы.
