Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции.
Гидролиз ДНК различными эндонуклеазами рестрикции проводили, согласно инструкциям фирм “СибЭнзим” (Россия) и “Fermentas” (Литва), используя для каждой эндонуклеазы рекомендованный буфер и соответствующий температурный режим.
ДНК разделяли и визуализировали с помощью электрофореза в агарозном геле, используя в зависимости от длины разделяемых ДНК 0.75% - 1%-ную агарозу и 1?ТВЕ буфер (табл. 3). Для оценки размеров фрагментов ДНК использовали ДНК-маркеры молекулярного веса “GeneRuler™ 100bp DNA Ladder” (“Fermentas”).
Очистка фрагментов ДНК.
Освобождение фрагментов ДНК от компонентов реакции проводили двумя способами: непосредственно из реакционной смеси или из агарозного геля после электрофореза.
Для этого к реакционной смеси или вырезанной полоске геля, содержащей нужный фрагмент ДНК, добавляли 5 объемов 5 М гуанидинтиоцианата, 0.1 М Tris-НС1 (рН 7.0) и 15 мкл суспензии кварцевого порошка “Silica” (100 мг/мл). При использовании полоски геля суспензию “Silica” добавляли после полного растворения геля. Полученную смесь центрифугировали 2 мин при 5000 об/мин. Осадок трижды промывали 750 мкл промывочного буфера (60% этанол, 80 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ Tris-НС1 рН 7.0) и высушивали. Элюцию ДНК проводили в 50 мкл буфера (10 мМ Tris-HCl, рН 8.5). В отдельных случаях фрагменты ДНК выделяли из агарозы и очищали с использованием набора “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” (“Promega”, США), согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Лигирование фрагментов ДНК.
Фрагменты ДНК после обработки соответствующей рестриктазой клонировали в вектор, раскрытый по тем же рестриктазам, либо ПЦР-фрагменты клонировали в вектор pZero-2, предварительно раскрытая по сайту EcorV .
Реакцию лигирования проводили в объеме 10 мкл, содержавшем 1?буфер для лигирования, 50-100 нг ДНК вектора и 3-5-кратный молярный избыток клонируемого фрагмента ДНК, 5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (“СибЭнзим”). Лигирование по липким концам проводили в течение 4-16 ч при 14°С. По окончании реакции ДНК-лигазу инактивировали прогреванием при 70°С 15 мин. Лигазную смесь использовали для трансформации в клетки E. coli.
Лигирование в кольца фрагментов хромосомной ДНК. Фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, лигировали сами на себя в объеме 0.5 мл. Лигирование проводили при 16°С в течение ночи с разведениями субстратной ДНК 0.1-0.5 мкг/мл и 5 ед. ДНК лигазы фага Т4. ДНК осаждали из лигазной смеси добавлением 2.5 объема этанола и 0.1 объёма 3М ацетата натрия, центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин, осадок промывали 80% и 96%-ным этанолом и растворяли в ТЕ-буфере. Полученную ДНК использовали в инвертированной ПЦР.
Получение компетентных клеток и их трансформация.
Получение компетентных клеток с применением CaCl2.Ночную культуру клеток (0.1 мл) вносили в 10 мл среды LB и выращивали при интенсивном перемешивании при 37°С до середины логарифмической фазы (А600= 0.4 - 0.6), охлаждали во льду 10 мин и центрифугировали (5000 об/мин, 5 мин при 4°С). Осторожно удаляли надосадочную жидкость, осадок ресуспендировали в 750 мкл 100 мМ СаСl2, выдерживали на ледяной бане 20 мин, центрифугировали в тех же условиях. После удаления супернатанта осажденные клетки ресуспендировали в 75 мкл 100 мМ СаСl2 и распределяли по 10 мкл в предварительно охлажденные пробирки. Полученные компетентные клетки использовали для трансформации сразу, либо после хранения при 4 °С не более 12-24 ч.
Трансформация компетентных клеток. К компетентным клеткам (10 мкл) добавляли лигазную смесь или раствор ДНК объемом 1-5 мкл, помещали пробирки в лед на 30 мин, а затем быстро переносили в водяную баню 42 °С на 2 мин и охлаждали во льду 10 мин. Добавляли в каждую пробирку 800 мкл среды LB и инкубировали при 37°С 1 ч. Клетки осаждали центрифугированием(14000 об/мин, 4°С, 15-30 сек), сливали надосадочную жидкость, ресуспендировали клетки в её остатках (50-100 мкл) и высевали на чашки Петри с агаризованной средой LB, содержащей антибиотики, необходимые для селекции трансформированных клонов.
Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.
Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочного лизиса (Sambrook and Russell, 2001). 3-4 мл ночной культуры E. coli, содержащей плазмиду, центрифугировали при 5000 об/мин в течение 5 мин, ресуспендировали в 250 мкл раствора I (табл. 8) и инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 250 мкл свежеприготовленного раствора II (табл. 8), осторожно перемешивали до полного просветления лизата. К лизату добавляли 250 мкл 3 М ацетата калия, перемешивали, оставляли во льду на 20 мин и центрифугировали (14000 об/мин, 30 мин) при 4 °С. Надосадочную жидкость переносили в пробирки, добавляли равный объем фенола, тщательно перемешивали и повторно центрифугировали, водную фазу отбирали в новую пробирку. Добавляли равный объем смеси фенол:хлороформ:изоамиловый спирт (25:24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали (14000 об/мин, 5 мин), водную фазу отбирали в новую пробирку. Затем добавляли равный объем смеси хлороформ:изоамиловый спирт (24:1), тщательно перемешивали и центрифугировали (14500 об/мин, 5 мин). Водную фазу переносили в новую пробирку и добавляли 0.7 объема изопропанола, инкубировали в течение 0.5-1 ч при -20 ?С. После центрифугирования осадок последовательно промывали 70%- и 96%-ным этанолом, высушивали и растворяли в 50 мкл ТЕ-буфера. Добавляли РНКазу, свободную от ДНКазы, до конечной концентрации 10 мкг/мл и инкубировали 15 мин при комнатной температуре. Затем в раствор добавляли 50 мкл смеси фенол:хлороформ (1:1), центрифугировали (14500 об/мин, 5 мин), отбирали верхнюю фазу, добавляли равный объем хлороформа, повторно центрифугировали. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, приливали 2.5 объема этанола и 5 мкл 3 М ацетата натрия. Для полного осаждения плазмидной ДНК пробы выдерживали 10 мин при -20 °С и центрифугировали (14000 об/мин, 10 мин). Осадок дважды промывали 80% и 96%-ным этанолом и растворяли в 30 мкл воды. Выход плазмидной ДНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле.
Создание праймеров и ПЦР.
Конструирование праймеров осуществляли с помощью программного пакета “VectorNTI®Advance v.9.0” и “OLIGO v.4.0”. Олигонуклеотиды синтезированы фирмой “Синтол” (Москва).
а) ПЦР с геномной ДНК проводили в термоциклере Hybaid (Англия) или Eppendorf (Германия). Реакционная смесь (30 мкл) содержала 50-100 нг ДНК, по 0.2 мM каждого из четырёх дНТФ, 1?ПЦР буфер (табл. 8), БСА 0.1 мг/мл, 40 пмоль каждого праймера (табл. 10) и до 3 ед. Taq-ДНК-полимеразы (“СибЭнзим”). Цикл амплификации состоял из денатурации ДНК при 94 °С - 2 мин, последующие 30 циклов: денатурации 94 °С - 30 с, отжига праймеров при 46-54 °С (в зависимости от праймера) - 30 с, и элонгации ДНК при 72°С - 2 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72°С, 4 мин.
б) Инвертированная ПЦР.
Для этой реакции в качестве матрицы использовали фрагменты хромосомной ДНК M.marina, полученные в результате гидролиза эндонуклеазами, замкнутые в кольцо в предварительной реакции лигирования. Перед ПЦР полученную кольцевую ДНК прогревали 15 мин при 95 °С. В реакции использовали праймеры (по 20 пмоль каждый) и Taq-полимеразу, остальные компоненты реакции были те же, что в стандартной ПЦР. Реакцию (30 циклов) проводили в следующем режиме: при температура плавления 94 °С - 30 с; при температуре отжига 54 °С - 40 с; при температуре синтеза 72 °С - 4 мин. Завершали амплификацию дополнительным синтезом ДНК при 72 °С - 8 мин.
в) Векторетная ПЦР
Cтратегия векторетного ПЦР заключается в создании адаптеров (двухцепочечных молекул ДНК) используя комплементарные олигонуклеотиды (вектореты), с последующим отжигом друг с другом. Отжиг комплементарных последовательностей vect57 и vect53 (табл. 5) проводили при температуре 65°С в течении 5 мин с последующим охлаждением во льду. Для стабилизизации полученного адаптера в реакционную смесь добавили MgCI2 до концентрации 25 мМ и инкубировали при 65°С в течении 5 мин, затем охлаждали в течении 1 ч при комнатной температуре.
Для векторетной ПЦР хромосомную ДНК (10 нг) инкубировали в присутствии 20 ед. рестриктазы BamHI при 37°С с последующей инактивацией рестриктазы при 65°С 20 мин. Лигирование разрезанной хромасомной ДНК и адаптеров проводили в присутствии 50 ед. T4 Ligase при 16°С 12-16 ч. Праймер C20 и специфичный для гена ask праймер AskF использовали в ПЦР для амплификации гена ask. Праймер C20 и специфичный для гена ectA праймер ectF использовали в ПЦР для амплификации гена ectA.
г) Амплификацию генов биосинтеза эктоина из хромосомной ДНК (10 нг) проводили с использованием прямого и обратного праймеров (15 пмоль каждого) (табл. 10). Для амплификации полного гена ectA из M. marina использовали праймеры EAN и EAС, для гена ectB - ectBN и ectBC, для гена ectС - ectСN и ectСC и для гена ask - AskN и PET19Z или AskN и BglII. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего гены ectАВС, использовали праймеры Opr1 и Opr2. Реакцию проводили, используя смесь ДНК-полимераз Tag/Pfu в соотношении активностей 20:1. Остальные компоненты реакции были те же, что и в стандартной ПЦР.
Коньюгация.
Для коньюгации использовали штамм-донор E. coli S17-лpir, который предварительно трансформировали коньюгативной плазмидой pBSL-180:Pmax:ectABC (полученной на основе рBSL-180). 10 мл ночной культуры E. coli центрифугировали 3 мин при 5000 об/мин и промывали 5 мл стерильной среды “K”. Клетки ресуспендировали в 0.5 мл среды “K”. В качестве реципиента использовали штамм Methylobacterium extorquens AМ1. 50 мл культуры, выращенной до ОП600=0.4, центрифугировали и промывали средой “K”. Клетки метилобактерий ресуспендировали в 0.5 мл среды “K” и смешивали с 0.5 мл суспензии клеток E. coli. Смесь переносили на агаризованную среду “К”, содержащую 0.2% Proteose peptone (“USBiological”, США), чашки инкубировали 24 ч при 28 °С. После инкубации клетки смывали с поверхности агара 2 мл стерильной среды “К”. Аликвоту суспензии 10-20 мкл растирали на селективной агаризованной среде “К”, содержащей 0.5% метанола и 30 мкг/мл канамицина. Чашки инкубировали до образования колоний (обычно 6 дней). Для удаления (присутствующих) клеток E. coli, трансконьюганты пересевали на агаризованную среду “К”, содержащую 20 мкг/мл налидиксовой кислоты и 30 мкг/мл канамицина.
4.6 Определение и анализ последовательностей нуклеотидов
Cеквенирование ДНК проводилось на фирме “Силекс” (Москва) с помощью “Big Dye Terminator Ready Reaction Kit” (“Applied Biosystems”, США) на автоматическом ДНК секвенаторе “DNA Sequencer ABI PRISM 310” (“Applied Biosystems”, США), в соответствии с инструкциями фирмы-производителя. Использовали 0.3-0.5 мкг ПЦР-фрагмента и соответствующий праймер. Для определения полной последовательности нуклеотидов в ДНК фрагментах, длина которых превышала 1000 п.н., на основе полученных последовательностей конструировали новые праймеры. Эти праймеры использовали затем для реакций секвенирования.
Сравнительный анализ последовательностей ДНК и белков проводили с помощью программы PSI-BLAST, доступной с сервера (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Анализ нуклеотидных последовательностей и их трансляцию в аминокислотные, определение сайтов рестрикции и открытых рамок считывания осуществляли при помощи программ GeneRuner 3.00, пакета программ VectorNTI®Advance v.9.0, DNAStar v.4.04 и Clone Manager 5. Выравнивание аминокислотных последовательностей осуществляли посредством программы ClustalX (v1.62b) (Thompson et al., 1997) и GeneDoc. Филогенетический анализ осуществляли с помощью пакета программ PHYLIP v.3.6, используя программы SEQBOOT, PROTPARS и CONSENSE (Felsenstein, 2004).
4.7 Клонирование и экспрессия гена ectA
Ген ectA, содержащий сайт для рестриктазы Nco при инициирующем кодоне и сайт на 3' конце фрагмента для HindIII, амплифицировали из геномной ДНК M. marina с использованием праймеров EctA(halN-N) и EctA(hal-C) (табл. 10). Фрагмент после обработки рестриктазами Nco и HindIII, содержащий ген ectA, лигировали в вектор pET28, с образованием вектора pETectA.
4.8 Выделение и очистка рекомбинантной ДАБ-ацетилтрансферазы
Клетки E. coli BL21(DE3), трансформированные плазмидой pETectA, выращивали в 0.5 л среды LB c Аmp (50 мкг/мл для pETectA) при 37 ?С до оптической плотности А600 = 0.6-0.7, добавляли Изопропил-в-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до конечной концентрации 1 мМ и инкубировали при 25 °С в течение 3 ч. Белок выделяли из суперпродуцента E. coli, как описано в протоколах фирмы “Quaigen” (Германия) с небольшими изменениями. Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в 5 мл лизисного буфера (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 20 мМ имидазола, 1 мМ фенилметансульфонилфторид (ФМСФ), 10 мг/мл лизоцима) и разрушали ультразвуком (3?0.5 мин с минутными перерывами). Лизат клеток центрифугировали 30 мин при 14000 об/мин и 4 °С, супернатант наносили на колонку, содержащую Ni2+-нитроацетат агарозу (“Quiagen”), объемом 5 мл. После промывки буфером (20 мМ Трис-НCl рН 8.0, 150 мМ КCl, 60 мМ имидазол) связанный белок элюировали с колонки тем же буфером, содержащим 150 мМ имидазола. Белковый спектр отобранных фракций, объёмом 0.5 мл, идентифицировали методом SDS электрофореза по Лэммли. Фракция, содержащая целевой белок (EctA-His6-tag), объединяли, диализовали против 50 мМ Трис-НCl буфера, рН 8,0 (содержащий 50 мМ КCl для ДАБ-ацетилтрансферазы и концентрировали с помощью Microcon YM-10 (“Millipore”, США).
Гель-фильтрацию белка EctAhal1-His6, проводили на колонке c Ultrоgel AcA54 (1.5?90 см), уравновешенной буфером, содержащим 50 мМ Трис-НСl, pH 8.0, 0.2 M NaCl. Скорость элюции - 15 мл/ч. В качестве маркеров молекулярной массы использовали набор стандартных белков (“Sigma” и “Pharmacia”): ферритин (450 кДа), БСА (66 кДа), ОВА (45 кДа), ДНКаза (31 кДа), лизоцим (14 кДа), цитохром с (12 кДа). Выход белка определяли по поглощению при 280 нм на УФ-детекторе (“LINEAR UVIS 200”, США).
4.9 Определение физико-химических свойств ферментов
Определение рН- и температурных оптимумов ДАБ-ацетилтрансферазы.
При определении рН-оптимумов применяли буферные системы рН 6.0-9.0. Использовали следующие буферные растворы: 100 мМ натрий-фосфатный буфер, рН 6.0-8.0; 100 мМ Трис-HCl буфер, рН 7.0 -9.0. Температурные оптимумы определяли в интервале температур от 5 до 35 ?С с использованием термоконтроллера “Shimadzu UV-160” (Япония).
Таблица 3. Буферы и растворы, использованные в работе.
Буферы/растворы | Применение | Состав | ||
Компоненты | Концентрация | |||
TBE, 5? | Электрофорез ДНК в агарозном геле | Трис-HCl Борная кислота ЭДТА, рН 8.0 | 0.445 М 0.445 M 0.01 М | |
ТЕ-буфер | ЭДТА Трис-HCl, рН 8.0 | 1 мМ 10 мМ | ||
10?ПЦР буфер | ПЦР | Трис-НСl, рН 8.9 (NH4)SO4 MgCl2 Tween 20 | 670 мМ 170 мМ 1.5 мM 0.1% | |
10?лигазный буфер | Лигирование фрагментов ДНК | Трис-HCl, рН 7.8 MgCl2 DTT АТФ БСА | 500 мМ 100 мМ 100 мМ 10 мМ 250мкг/мл | |
Раствор I | Выделение плазмидной ДНК | Глюкоза ЭДТА Трис-HCl, рН 8.0 | 50 мМ 10 мМ 25 мМ | |
Раствор II | Выделение плазмидной ДНК | NaOH SDS | 0.2 N 0.1% |
Таблица 4. Плазмиды, использованные в работе.
Плазмиды | Описание | Ссылка | |
pCM160 | OriT, OriV, Plac, PmxaF, LacZ', KmR | Marx and Lidstrom, 2001 | |
pET/ectA | Ген ectA из M. marina встроен в pET28b+ | Данная работа | |
pZero-2 | OriP, OriF1, Plac, KmR | “Invitrogen” | |
pZero/ectA | Ген ectA из M. marina встроен в pZero | Данная работа | |
pBSL-180 | Мини-Tn10 транспозон: ori R6K, mob, nptII R, ampR, lacI, tnp | M. F. Alexeyev, 1994 | |
pBSL-180/pmax/ectABC | Гены pmax/ectABC встроены в pBSL180 | Данная работа |
Таблица 5. Праймеры, использованные в работе.
Праймер | Ген - мишень | Последовательность (5'-3') | |
EctHal EctA(halN) EctA(halC) ectArev ectF HalR HalF Tra3 Hal-REV2 CR Rtn Askn Askg AskF Hal-AskF(ad) Hal-REV2 Ect-operN(hal) Ect-operC(hal) Ect-operC2(hal) RevHal HalEctR-C C 20 PmaxF PmaxR TF TR vect57 vect53 | ectA ectA ectA ectA ectA ectB ectB ectB ectB ectC ask ask ask ask ask ask ectABC ectABC ectABC ectR ectR адаптор pmax pmax pZero pZero | TTYGT(I)TGGCARGTNGC TTCCATGGCCAAAGACGTGAACGAGAT TTAAGCTTGGCTGCGGCCGAAGTC GCAGCAGCTCAATTAAC GATGGTGGTATTGAGGAGCTGC ACCATRTCYTCRAA CGGCTTTCGTATCGGTGTGC ACCGG(T/C)ACITT(C/T)TT(C/T)AGITT(C/T)GA GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC GGIGG(A/G)TT(A/G)AANAC(A/G)CA ACCATRTCYTGYTCRAA TGTCGCCGATCAGECTTCCAAC CCTTGTGGATGATCGCCTCGA TGCTGCTGGAACACAAGAAATC CGAGGCGATCATCCAGGAGTTC GCATAAGAAGTCCTTTCGCACC TTGAATTCATTAGTTAGTAGGACAAGCAA TTTGGGCCCACGCGCGACATCGAAGTGC TTAAGCTTACGAGCGACATCGAAGTGC TTCCGACAAGGCGCATTACAAGC TTTAAGCTTCAGGCGGTCATCC CTCTCCCTTCTCGAATCGTAA TTGGTACCGCTTGTCGGGCCGCTTGC TTGAGCTCATCCGCGGTATCTCTCAGACGTT CCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC GGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTT GAGAGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGGAG AGGGAAGAGAGCAGGCAAGGAATGCTAG CTCTCCCTTCTCGAATCGTAACCGTTCGTAC GAGAATCGCTGTCCTCTCCTTC |
