Клеточная поверхность: рецепторы, рециклирование мембран и передача сигналов
Клеточная поверхность: рецепторы, рециклирование мембран и передача сигналов
Введение
Все клетки должны иметь механизмы, позволяющие им контролировать состояние окружающей среды и отвечать на происходящие в ней изменения. В плазматических мембранах бактериальных, растительных и животных клеток содержится множество специализированных рецепторных молекул, которые, взаимодействуя с внеклеточными компонентами, вызывают специфические клеточные ответы. Одни рецепторы связывают питательные вещества или метаболиты, другие - гормоны или нейромедиаторы, третьи участвуют в межклеточном узнавании и адгезии или связывании клеток с нерастворимыми компонентами внеклеточной среды. Работа большинства рецепторных систем включает следующие стадии: 1) связывание лиганда или агониста с рецептором, расположенным на клеточной поверхности; 2) передачу внутрь клетки информации о связывании вещества с рецептором; 3) клеточный ответ, который в свою очередь делится ни первичный и вторичный. Эта бурно развивающаяся область исследований благодаря применению молекулярно-биологических подходов имеет блестящие перспективы. Становится ясно, что многочисленные, на первый взгляд не связанные друг с другом рецепторные системы имеют в своей основе много общего. Идентифицировано несколько семейств рецепторных белков с гомологичными первичными структурами; каждый белок связывается с характерным для него лигандом, что вызывает специфический клеточный ответ. Такие «суперсемейства» состоят из структурно родственных, но функционально различающихся белков. Это предполагает наличие неких модульных конструкций не только среди рецепторных белков в пределах данного семейства, но также среди других компонентов рецепторных систем, так что варианты одной и той же основной структуры рецепторного белка могут удовлетворять разнообразные потребности различных типов клеток, взаимодействующих с разными эффекторами. В частности, совершенно очевидна ключевая роль
Таблица 1. Некоторые суперсемейства структурно родственных рецепторов у эукариот
GTP_связывающих белков и продуктов распада фосфатидилинозитола в самых разных системах.
Мы рассмотрим также тесно связанный с предыдущим вопрос о динамических свойствах самой клеточной поверхности, в частности поверхности животной клетки. Рассмотрим динамическое равновесие между плазматической мембраной животной клетки и пулом внутриклеточных мембранных везикул, называемых эндосомами или рецептосомами, которые отшнуровываются от плазматической мембраны и способны опять с ней сливаться. Все это является частью сложного механизма внутриклеточного мембранного транспорта, протекающего также с участием других клеточных мембранных органелл, например комплекса Гольджи и лизосом. При поступлении соответствующих сигналов специфические белки плазматической мембраны, инкапсулированные во внутреннем мембранном пуле, быстро высвобождаются и оказываются на поверхности мембраны в активной форме. Некоторые макромолекулы, например липопротеииы низкой плотности, поглощаются клетками путем захвата отшнуровывающихся от плазматической мембраны везикул в процессе, называемом рецепторзависимым эидоцитозом.
1. Поверхность животной клетки
Прежде чем переходить к обсуждению структур различных мембраносвязанных рецепторов и механизмов индукции клеточного ответа, полезно рассмотреть строение поверхности животной клетки, поскольку большинство исследований в этой области выполнено на клетках животных. Плазматическую мембрану отличают от других клеточных мембран две особенности.
Относительно высокое содержание холестерола. Оценить долю холестерола клетки, находящуюся в плазматической мембране, довольно трудно, но ясно, что она весьма существенна. Высоким содержанием холестерола отличаются и другие мембранные структуры эндоцитозного пути. Еще один липид, содержащийся в значительных количествах в этих мембранах, - сфингомиелин.
Относительно высокое содержание гликопроизводных. Гликопроизводиые содержатся не только в плазматической мембране. Однако они присутствуют в ней в большом количестве. Все углеводные группы гликопротеинов плазматической мембраны находятся на наружной поверхности клетки, и зная места их прикрепления, можно определить аминокислотные остатки мембранных белков, обращенные наружу. Большинство белков плазматической мембраны гликозилированы. Полезно также помнить, что некоторые белки плазматической мембраны прикрепляются к ней с помощью фосфоинозитола и могут высвобождаться под действием фосфолипазы С, а другие белки присоединяются через ковалентно связанные жирные кислоты.
Физико-химические свойства холестерола в составе модельных мембран широко исследовались, однако функциональная роль холестерола в плазматической мембране до сих пор неизвестна. Далека от выяснения и биологическая функция углеводных частей гликолипидов и гликопротеинов.
В качестве примера рассмотрим поверхность эритроцита. Два преобладающих в этой мембране белка - белок полосы 3 и гликофории А - являются достаточно хорошо охарактеризованными гликопротеинами. Около 75°7» всех моносахаридов клеточной поверхности входит в состав гликопротеинов, а остальные 25% содержатся в гликолипидах, которые состоят из простых глобозидов и длинноцепочечных полилактозаминцерамидов. Эти гликолипиды составляют лишь несколько молярных процентов от общего количества липидов. Основные углеводсодержащие компоненты мембраны эритроцитов схематически представлены на рис. 9.1; указана максимальная протяженность Углеводных цепей. Рис. 9.2 иллюстрирует поверхность эритроцита в истинном масштабе, дающем представление о расстоянии между различными гликопроизводными. На самом деле углеводные цепи не выступают над клеточной поверхностью так, как это изображено на рис. 9.1 и 9.2, однако эти структуры, вероятно, играют важную роль при взаимодействии клеток с их окружением.
Углеводсодержащие соединения придают клеточной поверхности ярко выраженный гидрофильный характер. При этом отрицательный заряд в значительной степени определяется остатками сиалоных кислот, которые составляют семейство производных нейраминовой кислоты. В некоторых случаях сиаловые кислоты маскируют специфические сайты узнавания на молекулах клеточной поверхности. Существенно, что гликопроизводные определяют свойства участка, выступающего над клеточной поверхностью на ~ 100 А. Кроме того, эти специфические компоненты обладают уникальными биологическими функциями.
Так, было показано, что углеводные компоненты гликолипидов и гликопротеинов изменяются при развитии и дифференцировке клетки и могут служить антигенными маркерами, ассоциированными с опухолями. Ганглиозиды, представляющие собой содержащие сиаловую кислоту гликосфинголипиды, служат местом связывания холерного и столбнячного токсинов. Что еще более интересно - ганглиозиды непосредственно участвуют в регуляции процессов клеточного роста и дифференцировки, а также, по-видимому, воздействуют на фосфорилирование рецептора фактора роста эпидермиса - возможно, путем прямого взаимодействия. При этом роль углеводного компонента гликопротеинов, и особенно рецепторных белков, не совсем ясна. Гликозилирование может играть модулирующую или регуляторную роль при функционировании некоторых рецепторов, необходимых для межклеточной адгезии.
2. Рецепторы, определяющие клеточную адгезию
Один из основных классов рецепторов клеточной поверхности участвует в клеточной адгезии. Этот класс включает рецепторы, которые необходимы для узнавания клетками друг друга и для их адгезии, а также рецепторы, ответственные за связывание клеток с нерастворимыми компонентами внеклеточного матрикса, такими, как фибронектин или коллаген у животных. За связывание ответственны взаимодействия, как между белками, так и между белками и сахарами. Способность клеток к специфическому взаимному узнаванию и адгезии крайне важна для эмбрионального развития; выявлены некоторые компоненты клеточной поверхности, необходимые для этого. У взрослого животного адгезивные взаимодействия «клетка - клетка» и «клетка - матрикс» продолжают оставаться существенными для поддержания стабильности тканей. Те специфические системы, которые удалось исследовать, включают межклеточное узнавание при иммунном ответе, при миграции лимфоцитов к местам их назначения и при индукции адгезивных свойств у тромбоцитов при свертывании крови. Большую роль в исследовании этих систем сыграло использование методов молекулярной биологии, выявившее структурные взаимосвязи между рецепторами. Рассмотрим некоторые из рецепторов адгезии.
2.1 Cвязывание бактерий с гликолипидами
Множество бактерий образуют колонии на твердых субстратах, а в некоторых случаях прилипают к специфическим поверхностям. Из бактериальных структур, участвующих в этом процессе, лучше всего охарактеризованы ворсинки. Это длинные нитевидные отростки, не имеющие аналогов среди высших организмов. Примером могут служить ворсинки, обнаруженные у патогенных штаммов Е. coli, которые вызывают инфекционные заболевания мочевых путей человека. Ворсинка содержит -1000 белковых молекул, образующих спираль, на конце которой находится рецепторный белок, специфически связывающийся с дигалактозидсодержащими гликолипидами. Эти липиды присутствуют на поверхности эпителиальных клеток, выстилающих мочевые пути, где и размножаются бактерии. Заметим, что необходимым условием выполнения адгезином его функций является локализация этого белка на значительном расстоянии от клеточной поверхности, обычно покрытой липополисахаридами. Адгезии функционирует как лектин, т. е. сахаросвязывающий белок.
2.2 «Хоминг» лимфоцитов: стволовым кроветворным клеткам тоже нужны гликопроизводные
Лимфоциты непрерывно циркулируют между кровью и лимфоидными органами. Именно в этих органах концентрируется антиген из всех межклеточных пространств, подвергается процессингу и становится доступным для антигенспецифичных лимфоцитов, вызывая иммунный ответ. Лимфоциты мигрируют между кровотоком и лимфоидными органами по лимфатическим сосудам, и из всех клеток крови только рециркулирующие Т- и В-лимфоциты прилипают к внутренним поверхностям стенок этих сосудов и затем мигрируют к лимфоидным органам. Такая миграция называется «хомингом», и для этого необходимы специфические рецепторы на клеточной поверхности. Хоминг-рецептор - это белок с мол. массой -90 кДа, который ковалентно присоединен к убиквитину. Убиквитин представляет собой низкомолекулярный полипептид, ковалентно связанный с многочисленными цитоплазматическими белками и участвующий во внутриклеточной деградации белков. Роль убиквитина, присоединенного к виецитоплазматическому домену этого рецептора клеточной поверхности, неизвестна. Вероятно, однако, что подобным образом модифицируются и другие белки клеточной поверхности, поэтому такой механизм может иметь большое значение.
Хоминг-рецептор, по-видимому, является также лектином, который узнает углеводную часть гликосоединений на поверхности эндотелиальных клеток. В этом процессе участвует маннозо_6_фосфат.
Стволовые кроветворные клетки тоже способны к хомингу. Эти клетки, дифференцирующиеся в макрофаги и в клетки других типов, обладают сродством к клеткам стромы костного мозга и селезенки. Именно здесь происходит пролиферация и дифференцировка этих клеток. Хотя соответствующий рецептор и не был выделен, можно предположить, что он узнает галактозные и маннозные остатки гликопроизводных в тканях-мишенях. Поэтому взаимодействия белок / сахар важны для адгезии.
2.3 Молекулы, участвующие в клеточной адгезии
Для идентификации белков клеточной поверхности, участвующих во взаимодействиях между клетками, с успехом использовались моноклональные антитела. Соответствующие белки были названы молекулами клеточной адгезии, или САМ. Наиболее полно охарактеризовано семейство гликопротеинов, участвующих в адгезии нейронов. Сходные молекулы были обнаружены в мозгу мыши, цыпленка и человека. Во время развития отдельного организма N-CAM экспрессируются в нескольких формах в разное время в различных тканях. Не исключено, что сложная картина адгезии нейронов во время развития мозга обусловлена дифференциальной экспрессией и посттрансляционными модификациями небольшого числа молекул, а не участием большого количества высокоспецифичных белков адгезии. N-CAM являются гомофильными соединениями, т. е. молекула N-CAM одной клетки связывается со сходной молекулой другой клетки. Хотя эти белки адгезии гликозилированы, углеводы не являются необходимыми для взаимодействия, приводящего к связыванию. Однако гликозилирование может влиять на взаимодействие, так, при переходе от эмбрионального мозга к мозгу взрослого организма число остатков сиаловой кислоты в N-CAM уменьшается в три раза, что коррелирует с увеличением адгезивиости. Возможно, гликозирование играет регуляторную роль.
Другие посттрансляционные модификации N-CAM включают фосфорилирование сериновых и треониновых остатков в цитоплазматическом домене, ацилирование жирных кислот и сульфирование N_концевых олигосахаридов. Возможно, все эти модификации являются способами регуляции биологических функций N-CAM. Кроме того, из-за альтернативного сплайсинга мРНК N-CAM продуцируются в трех разных формах. Эти варианты N_САМ экспрессируются в разное время и в различных местах. Два из них предположительно содержат гидрофобную спираль, погруженную в мембрану, и протяженные С-концевые домены на цитоплазматической стороне мембраны. Эти две формы отличаются наличием в цитоплазматическом домене участка длиной 261 аминокислотный остаток. У третьей формы гидрофобный домен отсутствует, и, по-видимому, этот белок связывается с наружной поверхностью мембраны с помощью фосфоинозитольного мостика. Специфические биологические функции разновидностей N-CAM неизвестны.
Анализ аминокислотной последовательности N-CAM, проведенный с помощью кДНК, показал, что N-CAM относятся к иммуноглобулиновому суперсемейству. N-CAM содержат пять смежных доменов протяженностью - 100 аминокислотных остатков каждый, которые гомологичны ие только друг другу, но и иммуноглобулинам. Следовательно, N-CAM состоят из иммуноглобулиноподобных доменов и филогенетически родственны иммуноглобулинам. Это суперсемейство включает также другие белки клеточной поверхности, которые функционируют как рецепторы, в том числе Т-клеточный рецептор и главные комплексы гистосовместимости МНС. В него входит также миелинсвязанный гликопротеин, который, вероятно, участвует во взаимодействии между аксонами и миелинизированными клетками периферической нервной системы. По своей структуре он весьма сходен с N-CAM, что предполагает наличие общей структурной основы у представителей одного класса молекул клеточной адгезии.
Основную роль в функционировании N-CAM играют гомофильные белок-белковые взаимодействия между иммуноглобулиноподобными доменами. Однако N-CAM связывается также с гепарином с помощью домена, расположенного вблизи N_конца, и это взаимодействие может играть роль в межклеточных контактах. Таким образом, N-CAM полифункционален. На рис. 9.4 схематически представлена структура N-CAM, построенная по результатам исследований с использованием моноклональных антител.
Идентифицированы и другие виды САМ, отличные от N-CAM.
Один из них, нейроглиальный, или Ng-CAM, выделен из эмбриона цыпленка. N-CAM участвует в адгезии нервных клеток, a Ng-CAM - нервных клеток и клеток глин. Время появления и клеточная локализация Ng-CAM отличны от таковых у N-CAM. Возможно, запрограммированное появление Ng-CAM вместе с N-CAM помогает в регуляции образования нервной сети. Взаимодействия, в которых участвуют эти САМ, не зависят от ионов кальция.
Обнаружен отдельный класс белков САМ, которые опосредуют Са2 +-зависимые межклеточные взаимодействия. Эти белки были названы кадхеринами и включают в себя эпителиальный кадхерии, плацентарный кадхерин н увоморулин мышей. Гомолог Е-кадхерина цыпленка называется L^CAM; оба этих гликопротеина опосредуют взаимодействия между эпителиальными клетками. Сходство аминокислотных последовательностей Са2 +-зависимых белков САМ свидетельствует о том, что они образуют отдельное суперсемейство молекул адгезии. Например, результаты определения полной аминокислотной последовательности L-CAM по данным секвенирования кДНК показывают, что его мол. масса составляет 79,7 кДа, однако гомология с белком N-CAM отсутствует и L-CAM не принадлежит к суперсемейству иммуноглобулинов. Тем не менее, в молекуле САМ имеются три соседних гомологичных сегмента длиной по 113 аминокислотных остатков, а в молекуле N-CAM - пять таких сегментов, что указывает на сходство структурной организации упомянутых белков.
Дальнейшие исследования белков САМ прольют свет на механизмы межклеточного узнавания и адгезии во время эмбриогенеза и множества других клеточных процессов.
2.4 Рецепторы, участвующие в межклеточных взаимодействиях при иммунном ответе
При исследовании САМ выявился один неожиданный факт: в межклеточных взаимодействиях при эмбриогенезе участвует относительно небольшое число структурно различающихся САМ, а для взаимодействий между лимфоцитами, опосредующими иммунный ответ, наблюдается обратная картина. В индукции антител, направленных против специфического антигена, участвуют по крайней мере три разных типа клеток: 1) В-клетки, которые продуцируют антитела; 2) Т-клетки, которые секретируют факторы роста; 3) макрофаги, или дополнительные клетки. У каждой из этих клеток имеются поверхностные рецепторы, которые участвуют в специфических межклеточных взаимодействиях и в активации В-клеток с целью их дальнейшей пролиферации и секреции антител против специфического антигена. Известны два основных рецептора, участвующих в этом процессе: 1) Т-клеточный рецептор; 2) гликопротеины МНС класса II. Оба они входят в иммуноглобулиновое суперсемейство. Специфические межклеточные взаимодействия, участвующие в иммунном ответе, определяются в первую очередь белок-белковыми взаимодействиями между этими рецепторами клеточной поверхности. Приведем упрощенную последовательность событий.
Антиген захватывается А-клетками, подвергается процессингу и образует на клеточной поверхности комплекс с гликопротеинами МНС класса II.
Т-клетка взаимодействует с А-клеткой при участии Т-клеточного рецептора. Подразумевается, что Т-клеточный рецептор одновременно узнает глнкопротеины МНС класса II и антиген. При этом с А-клеткой будут взаимодействовать только Т-клетки с подходящими антигенспецифичными рецепторами. В популяции Т-клеток существует много разнообразных структур Т-клеточных рецепторов, однако каждая отдельная клетка продуцирует только один из них. Результатом такого взаимодействия между А- и Т-клетками является, в частности, образование факторов роста, которые стимулируют пролиферацию субпопуляции Т-клеток, а также других лимфоидных клеток.
В-клетки могут экспрессировать большое число разных мембраносвязанных иммуноглобулинов, но, как и в случае Т-клеток, индивидуальная В-клетка экспрессирует лишь один тип иммуноглобулина. В-клетки данной субпопуляции будут нести поверхностные иммуноглобулины, связывающиеся со специфическим антигеном, представленным системе. Активность и пролиферация В-клеток усиливаются при их взаимодействии с активированными Т-клетками и факторами, которые этими клетками высвобождаются. По-видимому, взаимодействие включает узнавание Т-клеткой антигена, который связывается с гликопротеинами МНС класса II на поверхности В-клетки. Это явление известно как МНС-ограниченная иммунная реакция. Пролиферация активированных В-клеток приводит к образованию популяции клеток, секретирующих антигенспецифичное антитело.
