Белки и пептиды. Показано, что слиянию везикул способствуют многие растворимые белки и амфифильные пептиды. Во многих случаях этот процесс зависит от рН и протекает только при протонировании соответствующих групп белковой молекулы. Например, в кислых условиях а-лактальбумин подвергается конформационному изменению, приводящему к экспонированию гидрофобной петли, что облегчает связывание с фосфо-липидными везикулами. Это каким-то образом облегчает слияние везикул. Слиянию фосфатидилхолиновых везикул способствуют два амфифильных пептида - мелиттин и 5_гемолизин из S. aureus. Оба они имеют гидрофобный участок, который может связываться с мембранами. Вероятно, благодаря локальному раазрушению бислоя преодолеваются электростатический и гидратационнный барьеры, затрудняющие агрегацию и слияние везикул. Высказывалось предположение, что при необходимости подобные гидрофобные пептиды могут образовываться и in vivo, однако убедительные данные на этот счет отсутствуют. Кроме того, известно, что отдельные участки белковых молекул могут вызывать такой же эффект без расщепления с последующим образованием пептидов.
4.2 Изучение белков, входящих в состав шиловидных структур оболочки вирусов
Конечно, описанная выше способность таких белков, как а-лак-тальбумин, облегчать слияние никак не связана с их физиологической ролью. Однако имеются белки, функция которых состоит именно в ускорении слияния мембран. Это гликопротеины шиловидных структур оболочки вирусов животных. Вирионы этих вирусов имеют бислойную липидную оболочку, с которой связаны вирус-специфические белки, опосредующие слияние вирусов с клеткой. Некоторые вирусы сливаются с плазматической мембраной, другие связываются с рецепторами на плазматической мембране и проникают в клетку путем эндоцитоза. Эти вирусы сливаются с мембраной эндоцитозных пузырьков только после закисления их содержимого.
Белки шипов выполняют две функции: 1) с их помощью вирусная частица прикрепляется к мембране животной клетки, обычно к гликопротеину или гликолипиду: 2) вероятно, они взаимодействуют непосредственно с мембраной клетки-мишени, так что мембраны вируса и клетки-хозяина приходят в тесный контакт и их слияние ускоряется. У некоторых вирусов функции прикрепления и ускорения слияния выполняют разные белки, а у других - один и тот же белок. В качестве примера можно привести В-белок вируса везикулярного стоматита и гемагглютинин вируса гриппа, участвующие в обоих процессах. Каждый из этих белков представляет собой гомотример, состоящий из трех идентичных субъединиц. Белки были очищены и встроены в липосомы, которые приобрели способность как к прикреплению, так и к слиянию. Способность к слиянию в обоих случаях проявлялась только при слабокислых условиях, которые соответствовали значению рН внутри эндоцитозных пузырьков. Эта способность, по-видимому, определялась небольшими сегментами белков, находящимися вблизи N_конца. Синтетический пептид из 25 аминокислотных остатков, соответствующий N_концевой последовательности В-белка вируса везикулярного стоматита, проявляет рН-зависимую гемолитическую активность, сходную с таковой самого вируса. Как соотносится это наблюдение со свойствами G_белка, пока неясно.
Гемагглютинин вируса гриппа - наиболее полно охарактеризован ная гликопротеиновая структура
Этот белок связан с вирусной мембраной с помощью короткого трансмембранного домена на С-конце. Он синтезируется как единая полипептидная цепь, но при созревании претерпевает протеолитическое расщепление с образованием двух полипептидов, HAi и НА2, связанных дисульфидной связью. Участок, отвечающий за слияние, локализован на N_конце НА2. Он соответствует N_концу G_белка вируса везикулярного стоматита.
С помощью рентгеновской кристаллографии была определена трехмерная структура водорастворимого домена гемагглютинина. Этот домен получают с помощью расщепления бромелаином. Он представляет собой трнмер из - субъединиц, напоминает по форме стержень и выступает из мембраны на 135 А. Каждая субъединица имеет а-спиральный «стебель» с глобулярной «верхушкой», которая содержит рецепторыый участок для сиалогликосоединений.
Гидрофобный фузионный пептид спрятан между субъединицами тримера и находится на расстоянии 30 А от поверхности мембраны. Как известно, при низких рН третичная и четвертичная структуры белка необратимо изменяются. При рН 5,0 белок приобретает способность связывать липиды и детергенты и самоагретируется, что позволяет думать об экспонировании гидрофобного домена. По-видимому, это коррелирует с экспонированием фузионного пептида, который теперь может связаться с мембраной-мишенью, способствуя сближению обеих мембран и облегчая их слияние. Были выделены и получены in vitro мутанты с другими рН-оптнмумом и фузноинымн свойствами. Это подтверждает важность контактирования субъединиц при рН-зависимом конформационном изменении структуры белка и роль фузионного пептида. Гемагглютинин ацилирован жирными кислотами, которые, по-видимому, усиливают фузионную активность.
Суммируя все сказанное выше, можно сделать вывод, что, хотя физико-химические механизмы слияния мембран до конца не установлены, очевидно, что специфическое слияние мембран внутри клетки может осуществляться с помощью некоего белокзависимого процесса. Для этого должно произойти специфическое межмембранное взаимодействие, обеспечивающее прикрепление мембран друг к другу, и должен присутствовать мембранный белок, который при необходимости обеспечивает слияние. Для изучения свойств таких белков можно использовать белки, образующие шиловидные структуры вирусных частиц. Но могут применяться и другие модельные системы. Вероятно, семейство таких белков участвует в слиянии мембран как при экзоцитозе, так и при эндоцитозе.
5. Рецепторные системы бактерий обладают некоторыми свойствами, присущими и высшим организмам
Во всех клеточных ответах участвуют системы передачи сигнала, которые преобразуют событие, происходящее вне клетки, - связывание лиганда с рецептором, - в сложный внутриклеточный ответ. Мы рассмотрим системы передачи сигналов у бактерий, а далее суммируем данные по таким системам у животных клеток.
Бактерии реагируют на изменение концентрации различных растворимых веществ в окружающей среде. Свободноплавающие бактерии, например Е. coli, обладают способностью к хемотаксису и при увеличении содержания в среде специфических питательных веществ перемещаются вверх по градиенту их концентрации, к источнику питания. В этом процессе участвуют рецепторы цитоплазматической мембраны, которые связываются с «привлекательным» для бактерии растворенным веществом и индуцируют серию событий в цитоплазме, приводящих к вращению жгутиков. Сходным образом клетки Е. coli реагируют на уменьшение концентрации фосфата или азота, синтезируя белки, которые придают клеткам способность «улавливать» эти компоненты из окружающей среды. В этом процессе также участвуют специфические рецепторы цитоплазматической мембраны.
Такие системы ответа активно изучались в первую очередь с помощью генетических и молекулярно-биологическнх методов. Данные по гомологии аминокислотных последовательностей позволили идентифицировать два семейства белковых рецепторов прокариот.
Рецепторы, участвующие в хемотаксисе и влияющие на вращение жгутиков.
Рецепторы, опосредующие ответы, которые влияют на аппарат транскрипции и активность генов.
Изученные типы рецепторов поражают своим сходством с рецепторами, характерными для клеток высших организмов.
5.1 Рецепторы, ответственные за хемотаксис Е. coli
К этому семейству белков относятся четыре рецептора. Их часто считают продуктами четырех генов - tsr, tar, tap и trg. Например, Wr_белок связывается с аттрактантом серином, а также опосредует хемотаксис в ответ на репеллент лейцин. Наиболее полно изучен рецептор для аспартата, который связывается с аттрактантом аспартатом, а также с мальтозосвяззывающим белком. Все четыре рецептора содержат единственную полипептидную цепь. Данные об их первичной структуре позволяют предположить, что это трансмембранные белки, которые имеют по две пронизывающие мембрану а-спирали. Характер укладки рецептора для аспартата, представленный на рис. 9.12, согласуется с результатами экспериментов по слиянию генов, а также с генетическими и биохимическими данными. Биохимические свойства рецептора для аспартата свидетельствуют о том, что он, по-видимому, представляет собой тетрамер. Все четыре хемотаксических белковых рецептора имеют высококонсервативные С-концевые половины, составляющие цитоплазматические домены; N_концевые части, составляющие периплазматические домены, гораздо менее консервативны.
Рецептор для аспартата выполняет три разные функции.
1. Связывание аспартата, за которое ответствен N_концевой домен, обращенный в периплазму. Белки с укороченным цитоплазматическим доменом тем не менее связываются с аспартатом нормально.
2. Передача сигнала, в которой участвуют аминокислотные остатки трансмембранных спиралей; об этом свидетельствуют результаты замещения лизина в положении 19 на аланин в первой трансмембранной спирали. Полученный мутантный рецептор связывает аспартат, но не индуцирует ответной реакции, что, вероятно, обусловлено изменением конформации белковой молекулы. Показано также, что рецептор может связываться с аспар-татом и с мальтозосвязывающим белком одновременно, при этом ответы усиливают друг друга. Природа конформацнонного изменения в рецепторе, индуцируемого связыванием лиганда, неизвестна, но, по-видимому, это изменение затрагивает значительную часть полипептида. Механизм, с помощью которого рецептор влияет на «мотор», приводящий в движение жгутики, также неизвестен; установлено только, что в нем участвует С-концевой домен рецептора и он может быть связан с фосфорилнрованием одного из других белковых компонентов системы.
3. Адаптация, которая заключается в том, что система способна реагировать на увеличение концентрации лишь непродолжительное время; через несколько минут рецептор десенсибилизуется, т. е. адаптируется к новой концентрации аттрактанта. Но затем рецептор вновь приобретает способность реагировать на дальнейшие изменения концентрации аттрактанта. Частично это связано с метилированием и деметилированием рецептора по нескольким глутаминовым остаткам, расположенным в цитоплазматическом домене. Адаптация отсутствует у рецепторов с укороченным С-концом; эта мутантная форма реагирует на аспартат в течение всего времени, пока последний находится в среде.
В ходе многочисленных экспериментов была продемонстрирована кажущаяся независимость функциональных доменов, расположенных на N- и С-концах белка. Такие белки обладали хемотаксической активностью по отношению к серину. Подобные конструкции наблюдались также у семейства рецепторов пептидных гормонов животных клеток.
Из всего сказанного можно сделать следующие выводы.
Существует семейство трансмембранных рецепторов с родственными последовательностями.
Наличие у рецепторов разных функций предполагает, что у них имеются разные структурные и функциональные домены.
И высшие, и низшие организмы обладают системой передачи сигнала, в которую вовлечены другие цитоплазматические белки, вероятно каким-то образом модифицирующиеся благодаря конформационному изменению, которое претерпевает рецептор при связывании лиганда.
Система адаптируется к сигналу, т. е. может отвечать на него лишь непродолжительное время. Это свойство присуще многим системам клеточного ответа; его называют также десенсибилизацией.
5.2 Рецепторы, участвующие в активации транскрипции
Это второе семейство рецепторов обнаружено у множества бактерий, которые отвечают на сигнал активацией транскрипции отдельных генов. Во всех случаях система имеет два белковых компонента: 1) сенсор, или рецептор, и 2) регулятор. Все рецепторы, по-видимому, имеют сходную структуру. Они содержат две трансмембранные спирали в N_концевой половине молекулы. С-концевые последовательности представителей этого семейства, находящиеся на цитоплазматической стороне мембраны, в значительной степени гомологичны. Регуляторные белки, по-видимому, находятся в цитоплазме в растворимой форме. Вероятно, рецепторы каким-то образом модифицируют эти белки, и затем они прямо или косвенно активируют транскрипцию. Возможно, модификация состоит в фос-форилировании; об этом свидетельствуют данные, полученные при исследовании системы ответа на ограничение концентрации азота.
Рассмотрение семейства бактериальных рецепторов показывает, что на основе одной структурной идеи может быть получено соответствие между самыми разными лигандами и ответами на них. Об этом же свидетельствует и изучение некоторых рецепторов животных клеток. Система передачи сигнала в животных клетках в отличие от бактерий изучена весьма детально.
6. Передача сигналов в животных клетках
Животные клетки реагируют на самые разные вещества, содержащиеся во внешней среде. Первым шагом при этом всегда является связывание лиганда со специфическим рецептором на наружной поверхности плазматической мембраны. Связывание с лигандом инициирует каскад специфических для данных клетки и рецептора событий, которые весьма интенсивно и плодотворно изучаются. Быстрое накопление новых данных в этой области вскоре потребует привлечения новых подходов для их систематизации. Однако наиболее общие проблемы здесь уже вполне ясны, даже при том, что многие детали малоизучены или неизвестны. Мы ознакомимся с этими центральными вопросами и теми связанными с мембранами биохимическими явлениями, которые уже хорошо охарактеризованы.
В табл. 1 перечислены рецепторы животных клеток, которые участвуют в передаче сигнала; многие из них были клонированы и была определена их первичная структура. Таблица составлена таким образом, чтобы подчеркнуть их структурное сходство. Большинство рецепторов, опосредующих передачу сигнала, связывают либо митогенные агенты, либо нейромедиаторы. К митогенным агентам относятся такие вещества, как ФРЭ, пептидные гормоны и регуляторные пептиды. Эти соединения регулируют рост клеток при различных условиях, в частности при эмбриогенезе, созревании клеток или их пролиферации, которая является частью иммунного ответа. К нейромедиаторам относятся адреналин, норадреналин, ацетилхолин, глицин и множество других малых молекул, участвующих в клеточном ответе.
Было бы полезно сказать еще несколько слов о классификации рецепторов, особенно рецепторов нейромедиаторов. В основе названий и классификаций этих рецепторов лежит их способность отвечать на различные агонисты и антагонисты, а также их физиологические функции и локализация. Однако тот факт, что имеются рецепторы, отвечающие на один и тот же агонист, означает, что классификация, основанная на свойствах и локализации, не может использоваться для разграничения рецепторных белков. Например, адренергические рецепторы, специфически связывающие катехоламиновые агонисты, такие, как норадреналин и адреналин, были сначала подразделены на типы а и 13 и далее на подтипы а, аг, 0\ и ft - Были выделены соответствующие рецепторные белки, правда, не все они строго вписывались в рамки классификации по фармакологическим признакам. Аналогичным образом по фармакологическим признакам были выделены два класса мускариновых холинергических рецепторов и идентифицированы по крайней мере четыре клонированных гена. Они отличались от никотинового ацетилхолинового рецептора по специфическому ответу на лекарственные препараты. Существуют также многочисленные классы рецепторов для гистамнна, дофамина, опиатов и других агонистов. Можно ожидать, что в будущем благодаря применению биохимических методов и методов молекулярного клонирования удастся идентифицировать разные рецепторные белки и установить механизмы клеточного ответа. Это позволит по-новому подойти к классификации рецепторов, основанной на их фармакологических свойствах.
6.1 Первичный ответ и семейства рецепторов
Лиганд, связываясь с рецептором, должен индуцировать в нем конформационный переход, приводящий к функциональным изменениям в других частях молекулы. Природа такого перехода абсолютно неизвестна. Установлено лишь, что по крайней мере в IgE_рецепторе с высоким сродством связывание лиганда индуцирует агрегацию рецептора в плоскости мембраны, однако нет никаких указаний на то, что это характерно для всех передающих сигнал рецепторов. Хотя структурные детали гормонов или нейромедиаторов остаются неизвестными, их важные функциональные особенности сейчас более или менее ясны. При связывании агониста происходят следующие три события.
Связывание агониста индуцирует открывание канала, образуемого рецептором. Примерами могут служить никотиновый ацетил-холииовый рецептор, рецептор 7_амнномасляной кислоты и глициновый рецептор. Все это рецепторы нейромедиаторов, которые структурно объединены в малое суперсемейство. На основании данных о первичной структуре этих рецепторов / ионных каналов для каждого полипептида была построена модель с четырьмя трансмембранными сегментами, однако экспериментальные исследования топологии nAChR еще не закончены.
При связывании лиганда активируется тирозиновая протеин-киназа, представляющая собой цитоплазматический домен рецептора. Обычно сам рецептор и является мишенью, но данные о том, какие именно белки фосфорилируются и как они влияют на клетку, практически отсутствуют. Этот механизм используют рецепторы митогенных пептидных гормонов и факторов роста, причем многие из этих рецепторов структурно родственны между собой. Каждый из этих рецепторных полипептидов имеет по одному трансмембранному сегменту.
3. Рецептор образует комплекс с одной из групп мембраносвязанных GTP_связывающих белков, называемых G_белками. При связывании лиганда с рецептором в комплексе peuenTop/G_белок происходит конформационное изменение, в результате чего облегчается обмен связанного GDP и GTP на G_белке.
Последовательность происходящих событий изображена на рис. 9.15. G_белок активируется на короткое время, будучи связанным с GTP, и в этом состоянии может отделиться от рецептора, причем одна или больше субъединиц G_белка могут связаться с другими мембранными белками, обозначенными на рис. 9.15 словом «мишень», оказывая на них определенное воздействие. К этим мишеням относятся ионные каналы, аденилатциклаза, cGMP/фосфодиэстераза и фосфолипаза С.
