Морфология и метаболизм дрожжей
36
Федеральное агентство по рыболовству
Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования
Астраханский Государственный Технический Университет
Кафедра «прикладная биология и микробиология»
Курсовая работа
на тему: «Морфология и метаболизм дрожжей»
Выполнил: ст. гр. ДБМ - 41
Проверил: д.б.н., проф.
Астрахань 2007
Содержание- Введение
- Глава 1. Морфология и метаболизм дрожжей
- 1. Морфология
- 1.1 Макроморфология
- 1.2 Микроморфология
- 1.3 Псевдомицелий
- 1.4 Диморфизм и плеоморфизм
- 1.5 Особенности метаболизма
- 1.5.1 Спиртовое брожение
- 1.5.2 Дыхание
- 1.5.3 Вторичные продукты метаболизма
- 1.6 Источники азота
- 1.7 Лимитирующие факторы
- 1.7.1 Температура
- 1.7.2 Кислотность среды
- 1.7.3 Ингибиторы роста
- 1.8 Промышленное использование дрожжей
- 1.8.1 Традиционные процессы
- 1.8.2 Дрожжи в современной биотехнологии
- Глава 2. Объекты и методы исследований
- 2.1 Объекты исследований
- 2.2 Отбор проб
- 2.3 Приборы для взятия проб
- 2.4 Методы стерилизации
- 2.5 Материалы и оборудование
- 2.6 Методы и способы обработки материала
- 2.7 Методы приготовления препаратов микроорганизмов
- 2.8 Выделение чистой культуры и проверка на чистоту
- 2.9 Получение культуральной жидкости
- Глава 3. Экспериментальная часть
- Выводы
- Список литературы:
- Приложение
- Среды
Введение
- Среди огромного разнообразия микроорганизмов, населяющих различные горизонты почв, обычно присутствуют и дрожжи. В то же время, численность дрожжей в почве невелика. Главным фактором, определяющим развитие дрожжей в почве, является концентрация легкодоступного органического вещества. Во всех типах почв численность дрожжей резко падает с глубиной, и наиболее заселенным является верхний 1-5см слой, непосредственно под подстилкой или слоем растительного опада.
Дрожжи играют большую роль в природных экосистемах. В трофических цепях эти дрожжи выступают как важное звено в питании беспозвоночных. Осуществляют процессы деструкции растительных остатков (Бабьева, Чернов, 2004).
- В последние десятилетия разнообразие биотехнологических процессов, в которых используются дрожжи, резко увеличилось. Еще более разнообразны перспективы использования дрожжей: в различных разработках, патентах и т.п. упоминается более 200 видов. Сейчас дрожжи используются для получения различных ферментных препаратов, органических кислот, полисахаридов, многоатомных спиртов, витаминов и витаминных добавок, а также во множестве других мелкомасштабных процессах.
- Целью исследовательской работы является выделение чистых культур почвенных дрожжей и создание питательной среды для культивирования базидиальных грибов на основе культуральной жидкости дрожжей.
Для достижения поставленной цели необходимо решить ряд задач:
- - выделение чистых культур дрожжей и изучение морфологических и культуральных свойств;
- получение культуральной жидкости различных видов дрожжей и подбор питательной среды для культивирования высших грибов.
Глава 1. Морфология и метаболизм дрожжей1. МорфологияДля характеристик дрожжевых грибов обычно используют макро- и микроморфологические признаки, т.к. первые изучают визуально культуральные признаки, а вторые - с помощью микроскопа. 1.1 МакроморфологияХарактеризует рост культуры в жидких или на плотных средах. Эти признаки очень изменчивы и сильно зависят от состава среды и условий культивирования, поэтому они имеют весьма ограниченное значение в систематике дрожжей. Но тем немее, многие виды дрожжей существенно отличаются по характеру роста на скошенном агаре или в виде гигантской колонии, что дает возможность их быстрой предварительной идентификации.
Дрожжевые культуры, растущие на плотных средах, по консистенции бывают чаще всего пастообразными, или стекающими полностью на дно пробирки, слизистыми, вязкими, клейкими, кожистыми или крошащимися. Слизистый рост характерен для многих анаморфных базидиомицетовых дрожжей родов Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces, а также для аскомицетовых почвенных дрожжей рода Lipomyces. У большинства аскомицетовых дрожжей колонии пастообразные, сухие, культура при росте на скошенном агаре не стекает на дно пробирки. Для дрожжеподобных грибов, образующих как одиночные клетки, так мицелий, характеры колонии с ворсинчатым краем, который хорошо просматривается при просвечивании.У большинства дрожжей колонии белые, часто приобретающие при старении кремовый или слегка коричневатый оттенок. У некоторых аскоспоровых дрожжей, например, из родов Nadsonia или Lipomyces, старые колонии при обильном спорообразовании темнеют и становятся бурыми или шоколадными. Многие дрожжи образуют пигменты, окрашивающие колонии в разные цвета. Наличие каротиноидных пигментов, придающих колониям красную, розовую, оранжевую или желтую окраску, характерно для базидиомицетовых дрожжей родов Rhodotorula, Sporobolomyces, Cystofilobasidium и др. Так же существуют дрожжи выделяющие в среду красно-вишневый пигмент пульхерримин. «Черные дрожжи» формируют темно бурые или черные колонии за счет накопления меланиноподобных пигментов.При росте в жидких средах дрожжи вызывают помутнение, образуют осадок, кольцо на стенках пробирки, разного характера пленки. Как правило, рост в виде пленки характеризует способность дрожжей объединяться в мицелиальные структуры или свидетельствует об окислительном типе энергетического метаболизма (Бабьева, Чернов, 2004).
1.2 МикроморфологияВключает признаки, характеризующие отдельные клетки (форма, размеры), а также способы вегетативного и бесполого размножения и образуемые при этом структуры.
Для большинства аскомицетовых дрожжей характерно многостороннее почкование, почка возникает на любом месте клеточной поверхности последовательно одна за другой, но у некоторых видов может закладываться одновременно несколько почек. В этом случае речь уже идет о множественном почковании. При полярном почковании закладка почек происходит только строго по полюсам клетки и каждая последующая почка возникает на месте предыдущей. При этом шрамы почкования нарастают один на другой и придают клетке характерную форму: грушевидную (у рода Schizoblastosporion) или лимонную, апикулятную (у родов Saccharomycodes, Nadsonia и др.).1.3 Псевдомицелий
У многих видов дрожжей в определенных условиях роста материнские и дочерние клетки после почкования не разъединяются, а продолжают почковаться. В результате возникают структуры, имитирующие мицелий. Такой мицелий называют ложным, или псевдомицелием. В отличие от истинного(септированного) мицелия, в нитях псевдомицелия между клетками обычно хорошо заметны перетяжки, а апикальные (концевые) клетки всегда короче предшествующих. Псевдомицелий, стоящий только из клеток одного типа, сходных по форме и размерам, называют примитивным (рудиментарным). Сложный псевдомицелий состоит из клеток более чем одного типа, обычно в нем резко различают длинные клетки, составляющие псевдогифы, и расположенные на них одиночные или собранные гроздьями круглые, овальные или клиновидные почки, которые в этом случае называются бластоспорами (рисунок №1). Образование псевдомицелия характерно для многих аскомицетовых дрожжей, например, из родов Candida, Pichia (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm) Рисунок 1. Примитивный - состоит из клеток одного типаСложный - состоит из клеток нескольких типов, обычно из удлиненных стволовых (псевдогифы) и более округлых мелких (бластоспоры).
1.4 Диморфизм и плеоморфизм
Для дрожжей, как и для других грибов, известны явления диморфизма и плеоморфизма. Мицелиально-дрожжевой диморфизм проявляется в том, что один вид может расти в двух формах - одноклеточной и мицелиальной. Это явление известно в микологии и связано с двумя типами роста - сферическим и апикальным. Есть дрожжи, которые образуют только одноклеточные популяции, хотя могут расти в виде конгломератов из отдельных клеток; они могут формировать структуры, внешне имитирующие мицелий. Типичный дрожжевой рост в процессе всего жизненного цикла характерен для многих видов аскоспоровых дрожжей. Другая группа дрожжеподобных грибов имеет либо мицелиальную, либо одноклеточную форму роста в зависимости от стадии жизненного цикла. Например, у базадомицетовых дрожжей обычно гаплоидная фаза одноклеточная, а диплоидная (дикариотическая) - мицелиальная.
Третья группа дрожжей проявляет дрожжевой или мицелиальный рост в зависимости от условий среды. Например, переход от одной клеточной фазе роста может быть связан с условиями аэрации.
О явлении плеоморфизма говорят, когда в жизненном цикле одного вида существуют два или несколько видов бесполого размножения. Плеоморфизм у дрожжеподобных грибов выражается в том, что наряду с основным типом вегетативного размножения почкованием или делением некоторые дрожжи образуют особые бесполые структуры, предназначенные специально для распространения или сохранения вида, например, баллитоспоры, эндоспоры, хламидоспоры. Баллитоспоры - это экзогенные споры (конидии), которые формируются на заостренных кончиках особых выростов - стеригм, и при созревании с силой отстреливаются за счет капельно-экскреторного механизма. Способность к образованию баллитоспор, рассеиваемых через воздушную среду, свойственна дрожжам, обитающим на надземных частях растений. Примерами являются дрожжи родов Sporidiobolus, Sporobolomyces, Bullera и др.Эндоспоры представляют собой бесполые эндогенные клетки, формирующиеся чаще всего в гифах мицелиальных дрожжей (например, Trichosporon) из участков цитоплазмы, которые отделяются мембраной и затем образую клеточную стенку. Количество эндоспор в одной клетке строго не фиксировано. После разрушения мицелия эндоспоры освобождаются и начинают почковаться. Эндоспоры ни по структуре, ни по устойчивости не отличаются от вегетативных клеток.Хламидоспоры - крупные сферические или овальные клетки, которые образуются как из одиночных дрожжевых вегетативных клеток, так и на мицелии: интекалярно, латерально или терминально, по одной или цепочками. Хламидоспоры на мицелии образует, например, Candida albicans (рисунок №2). В хламидоспорах значительно снижена метаболическая активность, их клеточные стенки обладают устойчивостью к действию литических факторов. Биологическая функция таких структур заключается в длительном сохранении жизнеспособности в условиях голодания или низкой влажности. (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm) Рисунок 2. Phaffia rhorozyma Candida albicansИстинный мицелий дрожжеподобных грибов имеет разное строение в зависимости от таксономического положения.1.5 Особенности метаболизма
Хотя дрожжи и не так разнообразны по своему метаболизму, как бактерии, различные виды дрожжей могут катаболизировать разные соединения углерода и азота и образовывать разные конечные продукты Рисунок 3. (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm.)1.5.1 Спиртовое брожение
Наиболее известное свойство многих дрожжей - способность к спиртовому брожению. Многие виды дрожжей могут переключаться с бродильного метаболизма на дыхательный и обратно в зависимости от условий: при наличии кислорода брожение ингибируется и дрожжи начинают дышать, в отсутствии кислорода включается механизм спиртового брожения. Так как кислородное дыхание - энергетически более выгодный процесс, чем брожение, то выход биомассы дрожжей в расчете на единицу используемого субстрата выше при выращивании их в аэробных условиях, чем в анаэробных. Это явление называется эффектом Пастера.Спиртовое брожение может идти не только в анаэробных условиях. Если выращивать дрожжи в присутствии кислорода, но при высоком содержании глюкозы в среде, то в этом случае дрожжи также сбраживают глюкозу. Таким образом, глюкоза подавляет процессы анаэробного дыхания. Это явление получило название эффекта Кребтри, или катаболитной репрессии.
Многие дрожжи вообще не способны бродить. По соотношению между этими двумя процессами в метаболизме можно выделить следующие группы дрожжей.
1. Дрожжи, существующие только за счет брожения и не способные расти в аэробных условиях. К ним относятся, например, вид Arxiozyma telluris, обитающие в кишечном тракте грызунов.2. Активные бродильщики интенсивно сбраживающие различные субстраты, но в анаэробных условиях переключаются на дыхательный обмен. Представители - Saccharomysec cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.3. Слабые бродильщики в основном существующие за счет аэробного дыхания, но в аэробных условиях могут бродить, однако значительно менее интенсивно, чем виды из предыдущей группы. Это аскомицетовые дрожжи из родов Pichia, Dedaryomycas, а также все способные к брожению базидиомицетовые дрожжи.4. Дрожжи существующие только а счет дыхания и не способные расти в анаэробных условиях. К этой группе относятся аскомицетовые дрожжи базидиомицетового аффинитета - Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces.Основными продуктами спиртового брожения являются этанол и углекислота, однако, в микроколичествах образуется также множество побочных соединений.
Субстраты брожения. Все бродящие дрожжи сбраживают глюкозу и фруктозу, поскольку именно с этих сахаров начинается гликолитическое расщепление. Кроме глюкозы и фруктозы могут сбраживать другие соединения, которые легко превращаются в интермедиаты гликолитического пути. В основном к ним относятся галактоза, из дисахаридов - сахароза, мальтоза, трегалоза. Значительно реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу и мелибиозу.Некоторые дрожжи способны сбраживать полисахариды. Например, Sacchoromycopsis fibuliger активно сбраживает крахмал.Долгое время не были известны дрожжи, способные интенсивно сбраживать пентозы. Такие виды были описаны только к началу 80-х гг. XXв. К ним относятся, например, Pichia stipis (несовершенная стадия - Candida shehatae), Pachysolen tannophilus (Бабьева, Чернов, 2004).1.5.2 ДыханиеПри росте в аэробных условиях при низком содержании глюкозы в среде дрожжи получают АТФ за счет процессов дыхания, как это делает большинство аэробных организмов. Полное окисление субстрата до углекислого газа и воды может происходить у дрожжей с помощью трех различных механизмов: в цикле трикарбоновых кислот, в глиоксилатном цикле и в пентозафосфатном цикле.
Спектр углеродных соединений, усваиваемых дрожжами за счет аэробного дыхания, значительно шире, чем в случае брожения.
1.5.3 Вторичные продукты метаболизма
В процессе роста дрожжи на ряду с основными продуктами (этанол, СО2) образуют множество других метаболитов, которые при катаболизме углеводов, обмене аминокислот и пр. Хотя соединения обычно накапливаются в культуральной среде в очень незначительных количествах и трудно идентифицируются, они могут иметь большое практическое значение, например, для пищевой промышленности, так как от их состава зависит качество пищевого продукта, получаемого с помощью дрожжей. Такие соединения называют органолептическими.Обязательные побочные продукты метаболизма дрожжей - высшие спирты (сивушные масла). Механизм синтеза высших спиртов связан с образованием алифатических аминокислот.
Чаще всего встречаются спирты: пропиловый, изоамиловый, бутиловый, изобутиловый. Летучие жирные кислоты, такие как уксуная, пропионовая, масляная, изомасляная, изовалериановая - также обычно минорные продукты метаболизма дрожжей. Большое практическое значение имеют выделяемые дрожжами альдегиды и кетоны (ацетоин и диацетил) (Бабьева, Чернов, 2004).
1.6 Источники азота
Универсальным источником азота для дрожжей являются соли аммония.
Многие дрожжи способны усваивать азот в окисленной форме - в виде солей нитратов и нитритов. Дрожжи, использующие нитраты, имеют две ферментные системы: первая восстанавливает нитрат до нитрита, вторая - нитрат до аммония. У некоторых видов присутствует только вторая ферментная система - они способны усваивать нитриты, но не нитраты. Способность к ассимиляции нитратов считается ценным таксономическим признаком, поэтому определение способности к росту на среде с KNO3 в качестве единственного источника азота - рутинный тест при идентификации дрожжей.Практически все дрожжи используют в качестве источника азота мочевину, расщепляя ее до СО2 и NH3.1.7 Лимитирующие факторы
За исключением нескольких исключительно холоднолюбивых видов, среди дрожжей нет ярко выраженных экстремофилов, то есть видов, предпочитающих крайне высокие или низкие значения температуры, рН, осмотического давления, влажности, среды, и т.п. В тоже время существуют дрожжи, которые сильно выделяются среди большинства других видов, которые сильно выделяются среди большинства других видов по своей способности переносить неблагоприятные факторы среды (http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm.).1.7.1 Температура
У большинства видов дрожжей минимальная температура роста находится в пределах 0-5°С, а максимальная - 30-40°С. Почти все дрожжи могут расти при комнатной температуре 20-25°С. Базидиомицетовые дрожжи в целом характеризуются более низкими максимальными температурами роста, чем аскомицетовые. Однако из этого правила есть ряд исключений.
В целом дрожжи - это довольно холоднолюбивая группа микроорганизмов. Часто это дает возможность создать селективные условия при выделении дрожжей методом посева на твердых питательных средах сильно мешают мицелиальные грибы, присутствующие в изучаемом субстрате. Колонии грибов маскируют более мелкие дрожжевые колонии и затрудняют их изоляцию. Подобрать какую-либо селективную только на одноклеточные грибы питательную среду, то есть ограничить рост мицелиальных грибов химически невозможно: все ингибиторы роста мицелиальных грибов действуют и на дрожжи. Однако при выращивании посевов при низкой (около 5°С) температуре дрожжеподобные колонии в среднем развиваются быстрее. Это дает возможность частично избавиться от колоний мицелиальных грибов.
1.7.2 Кислотность среды
Оптимальные значения рН для роста большинства дрожжеподобных грибов находится в области средней кислотности (рН4-6). Однако отдельные виды способны развиваться в более кислой среде. Например, некоторые штаммы Saccharomyces cerevisiae хорошо растут при рН 2,5-3. Практически все виды дрожжей могут расти в диапазоне рН 4-4,5. В то же время, в такой слабокислой среде не растет большинство банальных бактерий, которые наиболее обычны в самых разных природных местообитаниях. На этом основан простейший метод селективного выделения дрожжей: питательная среда (например, сусло агар) подкисляется НCL или молочной кислотой до рН 4-4,5. В большинстве случаев на такой среде вырастают только дрожжи и быстрорастущие мицелиальные грибы.
