Для глубинного посева берут 1 мл почвенной суспензии из разведения на порядок меньшего, чем для поверхностного посева.
Суспензию вносят в стерильную чашку Петри, заливают агаром, расплавленным и охлажденным до 45°С, и смешивают с ним. При глубинном посеве показатели получаются более низкие, чем при поверхностном (Теппер, 1994).
2.7 Методы приготовления препаратов микроорганизмовТехника взятия культуры для приготовления препарата
Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бактериологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.
Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и закрывают пробирку.
Фиксированные препараты микроорганизмов
Вводные пояснения. В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Под фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами (в целях безопасности).
Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжиривания стекол используют смесь этилового спирта и серного эфира в соотношении 1:1. Эти операции проводят вдали от горелок. Прокаленной бактериологической иглой из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см2.В случае, если суспензия густая, ее сначала разводят водой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажающей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют (Теппер, 1994).
Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки. Для этого препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки.Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьирует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
Существуют простые и дифференцированные методы окраски.
При простой окраске используют какой-либо один краситель, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка.
При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Грамму, окраски спор.
Окрашивание препарата по способу Грама
1. Метил-виолет 30 сек.2. Краску слить самотеком.3. Высушить мазок фильтровальной бумагой.4. Налить на 30сек. раствор люголя.5. Слить самотеком раствор люголя.6. Обесцвечивать спиртом 15 сек.7. Промыть препарат водой.8. Дополнительная окраска - разведенный фуксин 1 мин.9. Промыть препарат водой, высушить фильтровальной бумагой, микроскопировать с 90* объективом. 2.8 Выделение чистой культуры и проверка на чистотуЧистые культуры выделялись на среду Сабуро (см. Приложение №1), т.к. она содержит все необходимые питательные вещества для роста дрожжей.
Полученную культуру проверяем на чистоту методом посевов на селективные плотные питательные среды.
2.9 Получение культуральной жидкости
С помощью шпателя отбиралась биомасса культуры дрожжей, затем ее помещали в жидкую питательную среду (Сабуро). Культура инкубировалась в течение 1 недели в аэробных условиях, в данном случае мы использовали «качалку». После инкубации полученная жидкость центрифугировалась и стерилизовалась при 1 атмосфере.
В полученной культуральной жидкости могут присутствовать различные кислоты (молочная, масляная, пропионовая, яблочная), многоатомные спирты (глицерин, ксилит, эритрит, арабит), некоторые витамины группы В, в частности рибофлавина.
Глава 3. Экспериментальная частьВыделение почвенных дрожжей производилось чашечным методом, путем высева на различные питательные среды. Рецепт среды см. в приложении.
Проба №1 - почва с полевая (не посевная).
Проба №2 - почва лесная.
Проба №3 - почва садовая (парк АГТУ).Проба №4 - почва с луговая (заливная).
Проба №5 - почва из грибницы шампиньона.
При исследовании проб выявлена следующая закономерность: В пробах под номерами 1, 3 и 4 не было обнаружено дрожжей.Вероятно это можно объяснить тем, что эти почвы бедны легко доступными элементами питания. На этих почвах очень маленькая растительность, а как нам уже известно в основном они попадают в почв с растительным опадом. Почва не является для них истинным местом обитания, а лишь «ловушкой», местом сохранения или постепенного отмирания.
В пробе №2 на среде Сабуро была обнаружена колония дрожжей со следующими культуральными признаками: круглая, слизистая, с валиков по краю, оранжевого цвета, профиль выпуклый, пигмент в агар не выделяет. Микроскопия: крупные, округлые делящиеся клетки, находящиеся в скоплении, одноклеточного мицелия не образуют. С помощью ключа для определения родов дрожжей предполагается, что данная колония относится к роду Schizosaccharomyces.На глюкозо-пептонной среде этой же пробы была выделена колония другого рода дрожжей. Культуральные признаки: круглая, бархатистая колония, врастающая в агар, зеленовато-голубого цвета с белым кантом. Микроскопия: крупные клетки образуют мицелий, почкующиеся клетки отсутствуют. С помощью ключа для определения родов дрожжей предположительно установлено, что они относится к роду Galactomyces.Результаты исследований свидетельствуют, что разлагающиеся растительные остатки: опад, лесные подстилки, отмершие части мхов, торф - представляют собой типичные места обитания многих видов дрожжей. Свежий растительный опад, состоящий из листьев растений, сохраняющих анатомическое строение, практически всегда содержит дрожжи в количестве не меньшем, чем на надземных частях растений. В некоторых случаях численность дрожжей в опаде даже выше, чем на живых частях растений. Плотность заселения дрожжами растительного опада в значительной степени определяется количеством дрожжевых клеток изначально присутствовавших на листьях растений (Максимова, Чернов, 2004.)
С повышением степени разложенности растительных остатков средняя численность дрожжей убывает. В образцах нижних слоев лесной подстилки, перегнойных горизонтах почв дрожжи обнаруживаются далеко не всегда, и численность их может снижаться.
Проба №5
Таблица 1.Характеристика выделенных культур на среде Сабуро
Культуральные свойства | Морфологические свойства | |
Персикового цвета, округлая, блестящая не прозрачная, слизистая, гладкая колония, профиль выпуклый, пигмент в агар не выделяет. | Овальные, круглые иногда удлиненные клетки, почкование многостороннее, формируют примитивный псевдомицелий. Saccharomyces | |
Насыщенно розового цвета, округлая, слизистая, гладкая, не прозрачная колония, профиль выпуклый, пигмент в агар не выделяет. | Округлые клетки, размножающиеся делением, одноклеточные, мицелий не образуют. Schizosaccharomyces | |
Светло-оранжевого цвета, округлая, слизистая, не прозрачная, гладкая колония, профиль выпуклый, пигмент в агар не выделяет. | Клетки круглые, овальные или удлиненные, яйцевидные. Размножение истинным почкование. Формируют истинный септированный мицелий. Candida |
Скорость роста маточных культур исследовалась на основе картофельного агара с добавлением культуральных жидкостей из исследуемых образцов:
Образец № 1 - Candida Образец № 2 - Saccharomysec Образец № 3 - GalactomycesОбразец № 4 -Saccharomysec Образец № 5 - SchizosaccharomycesИнтенсивный рост отмечен на среде с добавление культуральной жидкости родов Candida и Saccharomysec (2,4).Шампиньон 2Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,4,5.Огневка
Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,2,4.
Вешенка (Sylvan)Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,4,.
Зонтик
Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 2,3,5.
Валуй
Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами образцов № 1,2.
Шампиньон 1
Результаты показали, что гриб растет быстрее с культуральной жидкостью дрожжей чем без неё, наибольший показатель роста был установлен с экстрактами всех образцов.
По данным характеризующих скорость роста исследуемых маточных культур на картофельном агаре с добавлением культуральной жидкости дрожжей установлено, что лучшие показатели скорости роста у шампиньона 2 и шампиньона 1. Мицелий исследуемых культур более плотный, чем на средах без добавления культуральной жидкости дрожжей. Это можно объяснить тем, что культуральная жидкость содержит рибофлавин являющийся как каталализатором для оптимального роста грибов.
Выводы1. В ходе проведения экспериментальных исследований различных проб почв на наличие почвенных дрожжей установлено, что видовое разнообразие дрожжей в зависимости от различных условий окружающей среды может изменяться.2. В результате постановки опыта выделены чистые культуры почвенных дрожжей: Schizosaccharomyces, Galactomyces, Candida, Saccharomyces.3. Интенсивность роста маточных культур базадиальных грибов на картофельной среде с добавлением культуральной жидкости дрожжей располагаются по убыванию:Candida > Saccharomyces (2) > Saccharomyces (4) > Schizosaccharomyces > Galactomyces. Список литературы:1. http://www.ss.msu.ru/soilyeasts/PicsList.htm2. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. - М.: Товарищество научных изданий КМК. 2004г., 221с.3. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.: Изд-во МГУ. - 1989 г., 336с.4. Зенова Г.М., Степанов А. Л., Лихачева А.А., Манучарова Н.А. Практикум по биологии почв.- М: МГУ, 2002. - 120с.5. Т.Ф. Черняковская, Т.Г. Добровольская и т.д. Микробиология, Экспериментальные статьи, 2004, том 73, №4, с.576-570.6. Мишустин Е.Н. Микроорганизмы и продуктивность земледелия. - М: Наука, 1972. - 342c.7. Теппер Е.З. и др. Практикум по микробиологии / Шильникова В. К., Переверзева Г.И. - М.: Агропромиздат., 1994. - 233 с.8. Бери Д. Биология дрожжей. - М.:Мир.,1985.9. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей. - М.: изд-во АН СССР., 1954. ПриложениеСреды
Мясопептонный агар (МПА)
К 1 л МПБ добавляют 15-20 г агара. Среду нагревают до растворения агара (температура его плавления - 100°С, затвердевания - 40 °С), устанавливают слабощелочную реакцию среды 20%-ным раствором Nа2СО3 и через воронку разливают в пробирки (приблизительно по 10 мл агара столбиком для последующего разлива по чашкам Петри и по 5 мл для получения скошенного агара - косяков).При разливе агара необходимо следить за тем, чтобы края пробирок оставались сухими, иначе пробки прилипнут к стеклу. Пробирки со средой стерилизуют в автоклаве при 120 °С 20 мин.
Глюкозо-пептонная:Состав среды | Количество компонентов, в г | рН среды | |
Глюкоза | 40 | 4-4,5 | |
Пептон | 10 | ||
Агар | 20 | ||
Дрожжевой экстракт | 4 | ||
Вода | 1000 |
Стерилизовать при 0,5 атмосфере.
Глюкозо-аммонийная:Состав среды | Количество компонентов, в г | рН среды | |
Глюкоза | 20 | 4-4,5 | |
(NH4)2SO4 | 5 | ||
KH2PO4 | 1,95 | ||
K2HPO4 | 0,15 | ||
MgSO4 | 0,5 | ||
NaCL | 0,1 | ||
CaCL2 | 0,1 | ||
Агар | 20 | ||
Вода | 1000 |
Стерилизовать при 0,5 атмосфере.
Эшби с сахарозой:Состав среды | Количество компонентов, в г | рН среды | |
Глюкоза | 20 | 4-4,5 | |
K2HPO4 | 0,2 | ||
MgSO4*7H2O | 0,2 | ||
NaCL | 0,2 | ||
K2SO4 | 0,1 | ||
CaCO3 | 5 | ||
Вода | 1000 |
Стерилизовать при 0,5 атмосфере.
Сабуро
Состав среды | Количество компонентов, в г | рН среды | |
Глюкоза | 40 | 4-4,5 | |
Пептон | 10 | ||
Агар | 18 | ||
Вода | 1000 |
Стерильная вода
Дистиллированную воду разлить по пробиркам по 10 мл. Стерилизовать при 1 атм. 20 мин.
Картофельный агар (г/л):очищенные и измельченные клубни картофеля - 200 гглюкоза-10 г агар-агар -15-20 г (или агароид 35-40г)вода - 1 л5.пивные дрожжи - 2 г (необязательно)Для приготовления картофельно-глюкозной среды клубни картофеля, очищенные, обмытые и нарезанные ломтиками, отваривают в 1 л воды до готовности (30 мин), отвар фильтруют, объем фильтрата доводят до 1 л. Добавляют глюкозу, агар-агар. Среду нагревают до полного расплавления агар-агара.
