ет, что канал имеет центральное отверстие диаметром 30 А с внеклеточного конца и значительно более узкое с ци-топлазматической стороны. На фотографиях четко видна пентамер-ная структура комплекса. Это означает, что пять субъединиц организованы вокруг центральной поры. Использование реагентов, образующих поперечные сшивки, показывает, что субъединицы расположены в следующей последовательности: /3--а--6--у--а, так что а-субъединицы не соседствуют друг с другом. По данным многочисленных исследований, места связывания ацетилхолина, других агонистов и конкурентных антагонистов располагаются на а-субъединицах. Следовательно, существуют два места связывания для этих химических агентов. Антагонисты препятствуют активации, вызываемой агонистами, или путем прямой конкуренции за связывание с теми же участками, или за счет связывания с каким-либо другим местом и, возможно, взаимодействия с каналом per se.
Как видно из рис. 8.8, nAChR-канал имеет длину около 140 А, причем участок длиной 70 А расположен над поверхностью бислоя с наружной стороны, образуя большие ворота канала. В клетках Torpedo канал существует в виде димерных единиц, связанных друг с другом дисульфидным мостиком между 6-субъединицами с внеклеточной стороны. Часть канала, выступающая из бислоя с цитоплазматической стороны, гораздо менее протяженна; по-видимому, она взаимодействует с элементами цитоскелета, что способствует образованию плотноупакованных кластеров канальных белков в концевой пластинке. Было высказано предположение, что эти взаимодействия опосредует особый белок мол. массой 43 000. В концевой пластинке каналы могут быть собраны в кластеры с плотностью до 10000 молекул на 1 мкм2, что близко к теоретическому пределу. При взаимодействии с ацетилхолином или другими агонистами через данный участок мембраны начинает течь электрический ток, деполяризующий постсинаптическую мембрану.
Кинетическое поведение nAChR-канал а можно с успехом анализировать, если рассматривать его как аллостерический фермент, способный находиться в нескольких конформациях. Существуют как минимум три состояния, в которых может находиться канал: открытое, закрытое и инактивированное. Для индукции перехода канала из закрытого состояния в открытое, в котором он остается около 1 мс, необходимо кооперативное связывание двух молекул ацетилхолина. В инактивированиом состоянии канал остается закрытым даже в присутствии ацетилхолина. Измерения проводимости одиночного канала свидетельствуют о наличии более чем одного открытого состояния, и кинетическая модель при этом оказывается достаточно сложной. Опыты по встраиванию канала в липидный бислой показали, что липидное окружение может влиять на способность канала к переходу из одной конформации в другую.
В открытой конформации канал проницаем для катионов и небольших неэлектролитов, но не анионов. Ограничения, налагаемые на размер проходящих молекул, позволяют судить о размерах наиболее узкой части канала. Соответствующие данные представлены на рис. 8.9 вместе с данными для двух других каналов. Радиус небольшого негидратированного иона, способного проходить через канал, является разумной оценкой предельных размеров канала. Непроницаемость канала для анионов и в три раза ббльшую проницаемость для катионов, чем для незаряженных молекул, можно объяснить электростатическими взаимодействиями, возникающими благодаря присутствию в воротах канала биполярных или отрицательно заряженных групп. Селективность канала по отношению к одно- и двухвалентным катионам невелика, но согласуется с моделью, в которой ионы даже внутри канала взаимодействуют главным образом с молекулами воды, а не с элементами собственно канала. Хотя размеры nAChR-канала относительно велики, он все же слишком мал, чтобы через него могли проходить полностью гидратированные ионы. Внутренняя полость канала должна содержать группы, которые могли бы легко заменить утраченные при дегидратации молекулы воды.
О молекулярной структуре этого канала известно больше, чем о структуре какого-либо иного канала. И все же, к сожалению, не выработано единой точки зрения на то, как построен данный канал, хотя было создано много достаточно детальных моделей. Большой вклад в исследование этого вопроса внесли работы с использованием методов молекулярной генетики. Так, при помощи клонирования генов каждой из субъединиц nAChR-канала из нескольких источников были определены аминокислотные последовательности этих субъединиц, анализ которых выявил наличие высококонсервативных участков. В качестве потенциальных трансмембранных а-спиралей было идентифицировано до семи различных сегментов. Наиболее интересен один из них, обозначаемый как М5 или МА; он может образовывать амфифильную спираль с заряженными группами, расположенными с одной стороны. Большинство исследователей полагают, что узкая часть канала, пронизывающая бислой, построена из субъединиц, каждая из которых образует а-спираль. Ансамбль а-спиралей формирует центральную пору. Первым кандидатом на эту роль является амфифильная спираль, хотя модельные исследования с грамицидином А с очевидностью показали, что наличие заряженных групп не является необходимым условием для образования наполненного водой катионселективного канала. Экспериментальные данные о прямом участии амфифильной спирали в формировании канала отсутствуют; даже вопрос о том, является ли эта спираль трансмембранной, не решен окончательно. Имеются данные, что в формировании канала участвует другая спираль, М2. Эти данные были получены при изучении связывания с каналом неконкурентных антагонистов и с помощью молекулярнно-генетических методов. Хотя спираль М2 не является амфифильной, она может образовывать канал, аналогичный грамицидиновому или аламетициновому. Отметим, что другие члены группы нейромедиаторных рецепторов не имеют участков, аналогичных амфифильной спирали никотинового ацетилхолинового рецептора.
В работах Нума и др. впервые были продемонстрированы возможности применения сайт-специфического мутагенеза при исследовании подобного рода систем. Гены, кодирующие каждую из четырех субъединиц канала, клонировали в cos-клетках обезьяны и ооцитах Хепорш и наблюдали экспрессию функциональных каналов в плазматической мембране. Для изучения работы таких каналов очень ценным оказались методы регистрации токов через одиночные каналы. Есть надежда, что с развитием подобных экспериментальных подходов мы сможем получить ответы на многие давно интересующие нас вопросы о строении каналов. Использование поликлональных и моноклональных антител поможет выявить те участки полипептидов, которые ответственны за связывание ацетилхолина, а также участки, формирующие собственно канал. В настоящее время большинство исследователей полагают, что этот канал образуется из а-спиралей, как аламетициновый канал. Те же представления легли в основу модели Na +-канала.
ПОТЕНЦИЛЗАВИСИМЫЙ НАТРИЕВЫЙ КАНАЛ
Потенциалзависимый натриевый канал обеспечивает быстрое увеличение натриевой проводимости, ответственное за фазу деполяризации при развитии потенциала действия в нервных и мышечных клетках. Этот канал был очищен до гомогенного состояния из нескольких источников, в частности из мозга крысы, скелетных мышц млекопитающих, сердца цыпленка и электрического органа ската Electrophorus electricus.
Очищенные каналы из Elektrophorus electricus и сердца цыпленка содержат единственную гликопротеиновую субъединицу с мол. массой -260000, в то время как каналы, выделенные из тканей млекопитающих, содержат еще одну или две меньшие субъединицы с мол. массой от ЗЗООО до 38 000. Большую часть из этих очищенных препаратов каналов удалось встроить в плоские мембраны, при этом они сохраняли присущие им in vivo электрофизиологические и фармакологические характеристики. Для успешной реконструкции канала, выделенного из тканей млекопитающих, необходим по меньшей мере один из небольших ассоциированных белков.
Натриевые каналы взаимодействуют с различными токсинами, в частности с тетродотоксином, сакситоксином и а-токсином скорпиона, которые очень прочно связываются с канальными белками и могут использоваться при количественных биохимических измерениях. Присутствие этих токсинов очень важно как для биохимической очистки каналов, так и для изучения их работы in vivo. Как и канал концевой пластинки, натриевые каналы распределены в плазматической мембране не равномерно, а собраны в кластеры. В мышечных клетках Na +-каналы сконцентрированы в районе концевой пластинки вместе с nAChR-каналами.
Нума с соавторами клонировали гены, кодирующие белки натриевых каналов из Electrophorus и главную субъединицу канала из мозга крысы, и определили их нуклеотидную последовательность. Было показано, что белок натриевого канала из Electrophorus содержит 1820 аминокислотных остатков, организованных в четыре повторяющиеся гомологичные единицы. По мнению разных авторов, каждый гомологичный участок содержит 4, 6 или 8 трансмембранных а-спиралей. Некоторые из этих предполагаемых трансмембранных спиралей амфифильны и аналогичны постулированным для nAChR-канала. Имеются экспериментальные данные о том, что карбоксильный конец полипептидной цепи локализован на цитоплазматической поверхности; сообщалось также, что амфифильная 54-спираль является внецитоплаз-матической. Однако никакой дополнительной информации, позволяющей подтвердить предложенные топологические модели, не существует. Нет также данных о том, какие участки полипептида непосредственно вовлечены в образование поры. Различные модели натриевого канала концептуально близки к моделям канала концевой пластинки в том отношении, что канал per se состоит из кластера а-спиралей, образующих центральную пору. В этом случае, однако, вместо пяти различных субъединиц мы имеем четыре гомологичных домена единственной субъединицы. По всей вероятности, специфичные группы организованы в канале таким образом, что образуется «селективный фильтр».
Предельные размеры канала можно оценить, используя метод «молекулярного сита», однако при этом нельзя объяснить селективность канала по отношению к достаточно малым ионам. На рис. 8.10 приведен профиль свободной энергии для диффузии ионов Na+ через канал. Если лимитирующей стадией является дегидратация, то параметром, определяющим высоту энергетического барьера, будет геометрия тех компонентов, которые временно заменяют воду. Для К+ положение соот-
ветствующих групп не будет оптимальным, поскольку этот ион несколько больше по диаметру, а потому энергетический барьер будет выше. Напротив, для К+-селективных каналов соответствующий энергетический барьер будет минимален именно для ионов К +.
В последнее время было построено также много моделей, описывающих регуляцию работы канала при помощи трансмембранного потенциала. В регуляции, без сомнения, участвует изменение заряда белка в ответ на наложение электрического поля. Однако никаких данных о том, какие именно участки полипептида образуют ворота или отвечают на изменение напряжения, не существует. Высказывается предположение, что это может быть амфи-фильная 54-спираль.
Данные об аминокислотной последовательности натриевого канала свидетельствуют о том, что он относится к группе потенциал-зависимых каналов. В эту же группу входят калиевый канал из Drosophila и дигидропиридиновый калиевый канал из скелетных мышц кролика. Все эти белки содержат амфи-фильный положительно заряженный сегмент, аналогичный S4-cer-менту натриевого канала. Это еще раз подтверждает вывод о том, что данный сегмент участвует в регуляции работы канала, отвечая на изменение напряжения на мембране. Отметим, что как натриевый канал из тканей млекопитающих, так и кальциевый канал следующий раздел) имеют субъединицы, функции которых неизвестны.
КАЛЬЦИЕВЫЙ КАНАЛ
Са2 +-селективные каналы очень широко распространены в возбудимых клетках -- нервных и мышечных, а также в большинстве других типов клеток. Некоторые Са2 +-каналы отвечают на изменение напряжения на мембране, а работа других регулируется опосредованно с помощью рецепторов. Обычно концентрация ионов Са2+ в цитоплазме не превышает 10"7 М, что в 10000 раз ниже, чем концентрация ионов Са2+ вне клетки. Из-за этих условий и в отличие от Na + - и К + -каналов открывание Са2 + -канала может приводить к значительным изменениям концентрации этого иона в цитоплазме, что в свою очередь индуцирует разнообразные биохимические события. Например, потенциалзависимое увеличение концентрации ионов Са2+ в цитоплазме приводит к высвобождению нейромедиаторов.
Исходя их фармакологических данных, была проведена классификация Са2+-каналов. Для очистки и дальнейшей харктеристики каналов очень полезными оказались органические блокирующие агенты с высоким сродством к каналам. Единственный класс Са2 + -каналов, охарактеризованных биохимически, -- это потенциалзави-симые каналы, которые блокируются различными органическими соединениями, в частности производными дигидропиридииа. Эти каналы были выделены из сердечной и скелетной мышц и оказались одинаковыми. Они состоят как минимум из двух субъединиц с мол. массой 140000 и 30000. Большая субъединица была клонирована и секвенирована и оказалась структурно близка к потенциалзависимому натриевому каналу.
Появляется все больше данных, свидетельствующих о сходстве структуры различных каналов и пор. В основе всех этих систем лежит заполненная водой пора, выстланная изнутри полярными группами. Пора может быть образована или а-спиральными, или 0-структурными элементами. Чтобы транспорт осуществлялся с высокой скоростью, в канале не обязательно должны присутствовать места связывания, обладающие высоким сродством к переносимым веществам, поскольку селективность определяется высотой энергетических барьеров, а не глубиной впадин. Селективность каналов можно в большинстве случаев объяснить тем, что в нескольких ключевых местах располагаются специфические аминокислотные остатки, определяющие характер тех веществ, которые могут проходить через канал. Возможно, воротные механизмы различных каналов также имеют много общего, но экспериментальные данные по этому поводу пока отсутствуют.
Как мы увидим позже, аналогичные структурные свойства можно обнаружить и у других транспортных белков.
Некоторые унипортеры, симпортеры и антипортеры
К настоящему времени достаточно хорошо охарактеризовано несколько систем, катализирующих транспорт одного или более растворимых веществ. При этом скорость переноса с помощью этих белковых комплексов гораздо ниже, чем даже через наиболее «медленные» каналы. Мы рассмотрим переносчик глюкозы и анионный переносчик из мембраны эритроцита, лактозопермеазу из Е. coli и группу митохондриальных переносчиков. Транспортные функции этих белков весьма разнообразны: оии катализируют облегченную диффузию одного какого-то вещества, симпорт Н + и сахара, в результате чего происходит накопление сахара в клетке, и антипорт растворенного вещества. Отметим некоторые общие свойства этих процессов.
В некоторых случаях эти транспортные белки являются оли-гомерами, обычно димерами. Однако, по-видимому, только у митохондриальных переносчиков канал образуется из структурных элементов разных мономеров. Во всех других случаях, по всей вероятности, каждая субъ-едииица функционирует независимо, даже если она является частью олигомера.
Весьма высокая степень гомологии транспортных белков указывает иа их близкое структурное родство, хотя они существенно различаются как по субстратной специфичности, так и по функциям. Это позволяет предположить, что для широкой группы функционально различных переносчиков характерны общие транспортные механизмы.
В большинстве случаев для анализа работы транспортных белков можно с успехом использовать модели с чередованием кон-формационных состояний, аналогичные модели, схематически представленной на рис. 8.2. При этом лимитирующей стадией является конформационное изменение с той стороной мембраны, где находится место связывания.
В большинстве случаев сродство переносчика к транспортируемому веществу не зависит от того, к какой стороне мембраны обращено место связывания. Однако для первичных активных транспортных систем наблюдается иная картина.
Все рассматриваемые здесь переносчики обычно чувствительны к реагентам, действие которых направлено на сульфгидрильные группы. Однако это не обязательно должно означать, что между переносчиками имеется значительное структурное сходство или они используют одинаковый механизм транспорта. Например, установлено, что ни один из восьми остатков цистеина лактозопермеазы не участвует непосредственно в транспорте. Высказывалось также предположение, что погруженные в мембрану остатки пролина распределены в транспортных белках непропорционально, однако значение этого факта остается неясным.
ПЕРЕНОСЧИК ГЛЮКОЗЫ ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТА
Этот переносчик охарактеризован наиболее полно из всех белков, катализирующих диффузию единственного вещества через мембрану. Он переносит через эритроцитарную мембрану D-глюкозу, которая затем используется при гликолизе. Такие же или аналогичные переносчики глюкозы присутствуют и в других типах животных клеток. Большой прогресс в этой области исследований был достигнут благодаря секвенированию ДНК, кодирующей переносчик глюкозы из клеток гепатомы человека и из клеток мозга крысы. Очищенный переносчик из эритроцитов представляет собой гликопротеин с кажущейся мол. массой 55 000. По-видимому, в мембране он находится в виде димера. Если судить по данным об аминокислотной последовательности, то переносчик должен содержать 12 трансмембранных а-спиральных участков, однако экспериментальные данные не дают окончательного ответа на этот вопрос. Очищенный переносчик удалось встроить в фосфолипидные везикулы, при этом оказалось, что он ориентирован асимметрично.
Как и при исследовании канальных белков, очень важную роль сыграли опыты с использованием специфических ингибиторов, обладающих высоким сродством к переносчику. В число этих ингибиторов входят цитохалазин В и флоретин, которые связываются с переносчиком со стехиометрией 1:1. Одни ингибиторы связываются с переносчиком только в том случае, если они находятся с цитоплазматической стороны мембраны, другие специфически связываются с наружной стороны мембраны. В работе было показано, что места связывания двух указанных ингибиторов находятся вблизи С-конца полипептида.
Большинство кинетических данных и данных по связыванию согласуются с простой моделью четырех состояний, в которой предполагается, что существует единственное место связывания D-глюкозы, находящееся внутри канала. Для измерения индивидуальных констант скоростей использовали ЯМР и метод остановленной струи. Конформация загруженного канала изменяется с константой скорости 2000 с~', которая приблизительно в семь раз выше аналогичной константы для незагруженного канала. Следовательно, обмен глюкозы происходит с большей скоростью, чем транспорт как таковой, для осуществления которого незагруженный переносчик должен возвратиться через мембрану. Природа конформационного изменения неизвестна, хотя оно было зарегистрировано при помощи инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье и, как предполагают, включает скольжение а-спиралей друг относительно друга.
Между переносчиком глюкозы из клеток млекопитающих и некоторыми транспортными системами бактерий наблюдается значительная гомология. Удивительно, что такая гомология наблюдается также между переносчиком глюкозы и белками, осуществляющими симпорт Н +-арабинозы и Н +-ксилозы. Эти сим-портеры, как и описываемая ниже система транспорта Н +-лактозы, используют для аккумуляции указанных сахаров электрохимический протонный градиент. Переносчик глюкозы из мембраны эритроцитов не транспортирует Н+ и не способен к транспорту против градиента глюкозы. Очень важными представляются работы по изучению взаимосвязи структуры белкового комплекса и механизма его работы.
