Этот комплекс изучен наиболее полно из всех симпортных белков. Он кодируется /асУ-геном, который является частью lac-оперона, и его часто называют lac-пермеазой. Ген lacY был клонирован и секвенирован, и из штамма-сверхпродуцента был выделен белок -- продукт этого гена. Пермеазу можно изучать в цитоплаз-матических мембранных везикулах, в интактных клетках или в реконструированных протеолипосомах. Судя по дан-
ным об аминокислотной последовательности, белок имеет мол. массу 46 500, хотя результаты электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН дают другую величину. Почти не вызывает сомнения, что функциональной единицей в мембране является мономер, хотя некоторые данные свидетельствуют о существовании димерной формы пермеазы in vivo.
На основании данных об аминокислотной последовательности лактозопермеазы были построена модели, согласно которым этот белок имеет 12 или 14 трансмембранных а-спиралей. Это в основном согласуется со спектроскопическими данными, свидетельствующими о высоком содержании а-спиралей, и немногочисленными топологическими данными. На рис. 8.11 представлена модель, построенная Кабаком, с указанием сегментов, которые, согласно экспериментальным данным, являются цито- или периплаз-матическими.
Пермеаза имеет одно или более мест связывания для протона и одно -- для лактозы. Эти места бывают поочередно обращены к периплазматической и цитоплазматической сторонам мембаны, и соответствующий коиформациониый переход является лимитирующей стадией процесса. Максимальная скорость транспорта равна 25--50 с~1. При наличии трансмембранного протонного электрохимического потенциала для лактозы составляет ~ 80 мкМ; место связывания протона, возможно, характеризуется высоким рКл, поэтому большую часть времени протонировано. При ДДН ¦ = 0 значение Км для лактозы гораздо выше -- 15--20 мМ.
Транспорт лактозы обязательно сопровождается транспортом Н+ со стехиометрией 1:1.
Конечным результатом транспорта является перенос через бислой положительного заряда. Следовательно, важную роль в установлении равновесия и скорости транспорта играют трансмембранный электрический потенциал и разность протонного химического потенциала.
Дополнение 8.4. Генетические подходы и сайт-специфический мутагенез: важные методы изучения лактоэопермеазы
Наиболее ценные данные при изучении лактоэопермеазы были получены с помощью генетических методов. Эти работы начали проводить сравнительно недавно, но уже ясно, что такого рода подходы помогут получить важные результаты при изучении как этой, так и других транспортных систем. С помощью направленного мутагенеза было показано, что при замене аланина-177 или тирозииа-236 данная пермеаза может переносить мальтозу. Эти сайты, отмеченные на рис. 8.11 кружками, могут участвовать в связывании сахара.
Кабак и его коллеги использовали сайт-специфический мутагенез для изучения механизма функционирования пермеазы. Было показано, что замена многих аминокислот не оказывает заметного влияния на кинетику транспорта. Это означает, что данные аминокислоты не принимают прямого участия в транспорте; более того -- их замена не приводит к «глобальным» конформационным изменениям белкового комплекса и не препятствует нормальной организации комплекса в мембране.
Были выделены три мутантные формы, неспособные катализировать определение стадии транспорта. Особенно существенны для нормального транспорта гистидин-322, глутамат-325 и аргинин-302; возможно, эти аминокислоты участвуют в переносе заряда внутри мембраны. Было высказано предположение, что они образуют некую связанную водородными связями группу между спиралями 9 и 10. Пермеаза, в которой глутамат-325 заменен на аланин, не может катализировать активный транспорт или выведение лактозы, но способна осуществлять нормальный обмен лактозы. Следовательно, нагруженная форма переносчика может претерпевать нормальные конформационные изменения, блокируется же какая-то другая стадия полного цикла, возможно депротонирование пермеазы. Можно надеяться, что именно с помощью такого рода экспериментов удастся понять механизм работы данного переносчика. При этом очевидно, что в интерпретации результатов ключевую роль могло бы сыграть установление трехмерной структуры фермента.
Как у Е. coli, так и у высших организмов имеются другие системы симпорта сахара и катионов. Однако лактозопермеаза не гомологична ни переносчикам Н +-ксилозы или Н +-арабинозы, ни переносчику глюкозы млекопитающих. Никакой гомологии не было обнаружено также между лак-тозопермеазой и мелибиозопермеазой из Е. coli. Последняя использует в качестве движущей силы для накопления мелибио-зы симпорт не только Н +, но также и Na +. Способность использовать Na +, по всей вероятности, исключает механизмы с перескакиванием протона по сети водородных связей в пронизывающей мембрану части переносчика. Известен также некий переносчик Na +-глюкозы, который катализирует накопление глюкозы в клетках щеточной каемки кишечника.
БЕЛОК ПОЛОСЫ 3 -- АНИОННЫЙ ПЕРЕНОСЧИК ИЗ МЕМБРАНЫ ЭРИТРОЦИТОВ
На долю белка полосы 3 приходится около 25% общего количества мембранных белков эритроцита человека; сходные белки присутствуют также в неэритроидных клетках. Этот белок выполняет несколько функции, причем их можно соотнести с двумя основными доменами белковой молекулы. N-концевая часть является гидрофильной и локализована с цитоплазмати-ческой стороны эритроцитарной мембраны. Она содержит места связывания для компонентов цитоскелета, а также для ферментов гликолиза и гемоглобина. Этот домен можно удалить путем протеолиза, не затронув С-концевого домена, который остается связанным с мембраной и опосредует С1"/НСОэ~обмен, а также образует канал в мембране, через который может проникать вода. Внецитоплазматический компонент этой части белка содержит также углеводные антигенные детерминанты нескольких систем групп крови. В мембране белок полосы 3 находится в форме димера или тетрамера.
Было проведено клонирование и секвенирование участка кДНК, кодирующего белок полосы 3 из эритроцитов мыши. Эти данные послужили основой для построения модели белка полосы 3. Было высказано предположение, что он имеет 12 трансмембранных а-спиралей, при этом некоторые из них являются ам-фифильными. Экспериментальные данные, подтверждающие эту гипотезу, получены только для нескольких участков полипептида и основаны главным образом на результатах протеолиза и локализации связанных углеводов.
Обширные кинетические исследования согласуются с моделью с чередованием конформации и одним местом связывания. Однако скорость равновесного анионного обмена с помощью переносчика по меньшей мере в 104 раз превышает скорость транспорта как такового. Следовательно, незагруженный переносчик не претерпевает быстрых конформационных превращений, необходимых для того, чтобы анион мог связаться с мембраной. По данным ЯМР с использованием 35С1, у переносчика имеется единственное место связывания, и оно может быть обращено как внутрь, так и наружу. Результаты опытов с использованием игнибиторов транспорта тоже свидетельствуют о том, что в канале имеется единственное место связывания аниона, локализованное где-то в середине канала. При этом предполагается, что переход этого места связывания с одной стороны мембраны на другую блокируется неким «скользящим барьером», который перемещается вдоль канала в результате конформационных изменений. Лимитирующей стадией является конформационный переход нагруженного переносчика, но происходит он достаточно быстро, с частотой 105 с ~1 при 37 °С. По-видимому, такая высокая скорость предотвращает значительные конформационные изменения в белке. Природа этого конформационного перехода и точная структура канала экспериментально не определены.
Конформационный переход загруженного переносчика, лимитирующий весь транспортный процесс, лишь в очень малой степени зависит от мембранного потенциала. Это согласуется с таким кон-формационным переходом, в результате которого через мембрану перемещается 0,1 связанного с белком заряда. Если этот переход сопряжен с перемещением анионного субстрата, то он должен сопровождаться переносом противоиона, например заряженной аминокислотной группы. В отличие от этого потенциалзависимое конформационное изменение, индуцирующее открывание натриевого канала, приводит к результирующему перемещению через мембрану шести связанных с белком зарядов.
ГРУППА МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ПЕРЕНОСЧИКОВ
Гомологичность некоторых транспортных белков внутренней митохондриальной мембраны свидетельствует об их близком родстве: по всей вероятности, они произошли от общего предка в результате дивергентной эволюции. Имеются по меньшей мере три представителя этой группы: 1) ADP/ATP-транслоказа; 2) переносчик фосфата и 3) разобщающий белок. В структуре этих белков имеется много общего, и тем не менее оии существенно различаются по субстратной специфичности. ADP/ATP-транслоказа катализирует транспорт ADP и АТР через бислой. При физиологических условиях АТР транспортируется из митохондрий, a ADP переносится в матрикс. Механизм этого процесса, по-видимому, аналогичен таковому для белка полосы 3, за исключением того, что АТР несет на один отрицательный заряд больше, чем ADP, и поэтому обмен зависит от трансмембранного электрического потенциала на митохондриальной мембране. Переносчик фосфата осуществляет одновременно и симпорт Н +, и, во-видимому, механизм его работы сходен с описанным ранее механизмом для Н + -лактозопермеа-зы из Е. coli. Этот белок катализирует транспорт фосфата внутрь митохондрий. Благодаря симпорту Н+ процесс в целом является электронейтральным и не зависит от трансмембранного потенциала. Разобщающий белок был обнаружен в митохондриях из клеток бурого жира млекопитающих; его функция заключается в диссипации протонного электрохимического градиента, создаваемого при функционировании дыхательной цепи, в результате чего генерируется тепло. Разобщающий белок может также катализировать транспорт анионов, например CI ~, так что, может быть, на самом деле он катализирует транспорт ОН ~, который невозможно экспериментально отличить от транспорта Н+. Этот переносчик связывается с нуклеотидами, которые ингибируют транспорт, и его работа может регулироваться жирными кислотами.
Все три переносчика, а возможно, еще и а-кетоглутарат/малат-транслоказа, имеют сходное строение; этот вывод был сделан на основе данных об их аминокислотной последовательности. Все они имеют мол. массу около 33 000 Да и состоят из трех гомологичных доменов, каждый из которых содержит ~ 100 аминокислот. По всей вероятности, эти три домена образовались в результате утроения единственного гена. Была построена модель, согласно которой каждый из гомологичных доменов дважды пересекает мембрану, а вся субъединица содержит шесть трансмембранных а-спи-ралей. С этой моделью согласуются данные по химической модификации. Отметим, что такая структура имеет много общего с Na + -каналом, состоящим из четырех родственных гомологичных доменов. ADP/ATP-транслоказа является димером и, по-видимому, содержит единственный канал, по которому осуществляется транспорт. Такой вывод основывается на результатах исследований по связыванию ингибиторов с высоким сродством.
Несколько примеров активных переносчиков, использующих энергию гидролиза АТР или фосцЪоенолпирувата
Сделаем несколько замечаний, касающихся первичных активных переносчиков. Охарактеризовано довольно много систем, с помощью которых происходит сопряжение транспорта тех или иных веществ через мембрану с гидролизом макроэргической фосфатной связи или с другой реакцией, в ходе которой высвобождается энергия. Мы не стремимся дать подробный анализ обширной литературы по данному вопросу, а хотим лишь отметить некоторые основные особенности строения и механизма работы этих транспортных систем в контексте того, что мы уже узнали о других группах транспортных белков.
Как мы уже отмечали, в основе кинетических моделей многих первичных активных транспортных систем лежит концепция чередования конформационных изменений. При этом совершенно необязательно, чтобы реакция, в ходе которой высвобождается энергия, например реакция гидролиза АТР, была прямо сопряжена с конформационным переходом, необходимым для транспорта, как это показано на рис. 8.2; важно лишь, чтобы такое сопряжение существовало с одной или несколькими стадиями кинетического цикла. Требования, предъявляемые к структуре трансмембранного «канала» первичного активного переносчика, аналогичны таковым для других переносчиков, но здесь возникает дополнительная сложность -- необходимость контроля сопряжения химической реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта растворимого вещества.
О молекулярной структуре первичных активных транспортных систем известно даже меньше, чем о транспортных белках. Идентифицировать группы родственных переносчиков, близких по строению и механизму работы, помогают данные об их аминокислотной последовательности, которых становится все больше. Однако достоверные данные о том, каково строение участков, непосредственно вовлеченных в транспорт веществ, отсутствуют. В основе различного рода структурных моделей активных переносчиков лежит предположение о том, что трансмембранный канал, через который транспортируются вещества, образован кластером трансмембранных амфифильных а-спиралей. Сходным образом и модели, описывающие сопряжение химических реакций и транспорта веществ, опираются на весьма немногочисленные экспериментальные данные. Модели сопряжения можно разделить на две главные группы. Согласно модели прямого сопряжения, химическая реакция оказывает непосредственное влияние на перенос транспортируемого вещества, причем этот процесс не требует значительных опосредованных белком конформаци-онных изменений. Например, протоны, участвующие в гидролизе АТР, могли бы быть именно теми ионами, которые транспортируются через мембрану в ходе данной реакции. Для этого необходимо, чтобы участок комплекса, где протекает химическая реакция, и участок связывания транспортируемого вещества были расположены очень близко друг к другу. В отличие от этого в модели непрямого сопряжения химическая реакция оказывает влияние на транспортный процесс через опосредованные белком конформационные изменения. Допускается даже, что химическая реакция и активный транспорт могут быть связаны с разными субъединицами внутри комплекса. Эти модели имеют то преимущество, что с их помощью нетрудно объяснить транспорт различных веществ одними и теми же или близкородственными белками при участии одних и тех же механизмов.
Активные транспортные системы функционируют со скоростями, типичными для многих ферментов, т. е. 102--103 с" 1 в условиях насыщения. В отличие от канальных белков селективность в отношении субстрата обусловливается главным образом сродством транспортируемого вещества к активному переносчику. Более того, большинство первичных активных переносчиков обычно функционирует в условиях, когда концентрация переносимого вещества с #ис-стороны близка или немного превышает Км и лимитирующей стадией транспорта является конформационный переход белка или химическая реакция, служащая источником энергии для данной системы.
И наконец, роль первичных активных транспортных систем заключается в перемещении вещества через мембрану против его концентрационного градиента в одном направлении. Поскольку переносчик после высвобождения транспортируемого вещества должен опять изменить свою ориентацию с транс на цис, необходим какой-то механизм, препятствующий возвращению на цис-сторону загруженного переносчика. Следовательно, сродство активного переносчика к транспортируемому веществу должно быть| выше с г/ис-стороны, чем с т/7Анс-стороны. Если бы это было не так, переносчик работал бы очень неэффективно при высоких концентрациях субстрата с m/юнс-стороны. В такой реакции энергия затрачивается главным образом на изменение сродства переносчика к транспортируемому веществу. Например, фосфорилирование Na + /К + -АТРазы или Са -АТРазы при помощи АТР ведет к стабилизации конформации тех переносчиков, у которых место связывания ионов обращено наружу и которые имеют низкое сродство соответственно к Na + или Са2 +. В то же время связывание АТР стабилизирует ту форму Na +/К +-АТРазы, в которой места связывания ионов, обращенные к цитоплазме, имеют низкое сродство к К*. Следовательно, механизм сопряжения реакции, в ходе которой высвобождается энергия, и транспорта, катализируемого активными переносчиками, лучше всего рассматривать исходя из термодинамических принципов, т. е. как временную стабилизацию определенных конформации и изменение сродства к транспортируемому веществу.
Можно выделить пять групп переносчиков, которые используют свободную энергию макроэргической фосфатной связи для осуществления транспорта веществ, т. е. Природа нашла несколько путей решения этой задачи.
ПЕРЕНОСЧИКИ КАТИОНОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ: АТР-ЗАВИСИМЫЕ ИОННЫЕ НАСОСЫ
Несколько про- и эукариотических ионпереносящих АТРаз составляют единое семейство и обладают сходными аминокислотными последовательностями и механизмами переноса ионов. Наиболее полно охарактеризованы Na + /K+-ATPa3a из плазматической мембраны животных клеток и Са2 + -АТРаза из сар-коплазматического ретикулума. Большинство ферментов этой группы представляют собой единый полипептид с мол. массой 100 000; исключение составляет Na +/К +-АТРаза, выделенная из нескольких источников, которая содержит вторую, меньшую субъединицу с неизвестной функцией. Эти переносчики ингиби-руются ванадатом и прямо фосфорилируются АТР с образованием фосфорилированного интермедидата, играющего важную роль в транспорте. Катионные переносчики этой группы значительно различаются по ионной специфичности. Неодинакова и стехиометрия транспорта. Например, Са2 +-АТРаза переносит 2Са2 + /АТР в полость саркоплазматического ретикулума, в то время как Na+/К +-АТРаза переносит 3Na+ наружу и 2К + в цитоплазму через плазматическую мембрану. При этом различия в работе АТРазы касаются не только стехиометрии и природы переносимых ионов, но также и того, что Са2 + -АТРаза способна переносить ионы лишь в одном направлении, в то время как Na + /K+-АТРаза делает это в обоих направлениях.
Название «фермент Е1Е2-ТИГЩ» было введено в работе, посвященной Na +/К +-АТРазе. Как показали исследования, этот белок существует по меньшей мере в двух различающихся конформациях, для которых характерны разное связывание субстратов и неодинаковая подверженность мягкому протеолизу. Форма Е, соответствует конформации, в которой места связывания ионов обращены в сторону цитоплазмы и которая обладает высоким сродством к АТР. Места связывания ионов в фосфорилированной форме Е2 обращены наружу. На рис. 8.12 изображен транспортный цикл, в котором участвуют две ненагруженные формы переносчика и две нагруженные, Е2 CBCM3, со «спрятанными» внутри насосного комплекса ионами. Изучение связывания К + фосфорилированной формой переносчика показало, что оно происходит в двух разных местах.
Отметим основные особенности каталитического цикла.
Ei-форма связывает три иона Na+ с цитоплазматической стороны мембраны и затем взаимодействует с АТР, образуя фосфори-лированный фермент. Фосфорилируется при этом специфический ас-партат, консервативный в этой группе ферментов.
После отсоединения ADP ионы оказываются «спрятанными» внутри комплекса.
