Биотехнология глутамата натрия

Биотехнология глутамата натрия

Содержание

Применение продукта

Характеристика продукта

Характеристика продуцента

Состав питательной среды

Механизм биосинтеза

Условия биосинтеза

Описание процесса биосинтеза

Выделение продукта

Активаторы и ингибиторы процесса

Возможности генной инженерии

Выход продукта

Определение стехиометрических коэффициентов и теплового эффекта реакции

Список используемой литературы

Применение продукта

Глутамат натрия применяют для усиления природных вкусовых свойств пищевых продуктов, сохранения вкусовых качеств пищевых продуктов при длительном хранении, восстановления первоначального вкуса в продуктах, которые подвергаются термической обработке.

Она применяется при изготовлении блюд из мяса, рыбы, птицы, овощей, бобовых, усиливая их природные вкусовые особенности. Специфический "мясной" вкус глутамата натрия ощущается при концентрации от 0,03% и более. Его используют при приготовлении изделий из низкосортного и мороженого мяса, которое при хранении частично утратило свои первоначальные свойства, а также при применении соевых белков и других заменителей мяса.

Количество глутамата натрия при производстве колбасных изделий, продуктов из свинины, говядины, баранины, конины, полуфабрикатов и др. составляет 0,05-0,15% к массе сырья. Для консервированных море- и рыбопродуктов его расходуется больше - от 0,1 до 0, 5%. Глутамат натрия может добавляться в продукт вместе с солью. При этом дозировку соли уменьшают на 10%.

"Глутаминовый эффект" лучше всего проявляется в слабокислой среде - при рН 5 - 6, 5. В более кислой среде эффект усиления вкуса снижается, а при рН 4 теряется вовсе.

Глутамат натрия изобретен давно. В начале XX века японский ученый Кикунае Икеда, занимаясь изучением соевого соуса и других продуктов, характерных для Юго-Восточной Азии, пытался ответить на вопрос, почему пища, сдобренная некоторыми сушеными водорослями, становится более вкусной и аппетитной. Оказалось, такой эффект дает содержащаяся в них глутаминовая кислота. В 1909 году ученому был выдан патент на способ производства пищевых препаратов. По этому способу была получена соль глутаминовой кислоты - глутамат натрия. А в 50-х годах прошлого века выяснили, что глутамат мононатрия (на иностранных продуктах пишут - MSG) удивительным образом помогает производить запахи и вкусы, подобные мясу.

С тех пор усилитель вкуса - глутамат натрия - стал широко применяться и завоевал популярность во всем мире. Его ежегодное потребление на планете достигло 200 тысяч тонн.

Характеристика продукта

Глутамат натрия (monosodium glutamate - лат., сокращенное наименование - MSG) - мононатриевая соль глутаминовой кислоты. Широко используется в качестве дешевой пищевой добавки для усиления вкусовых ощущений. В наибольшей степени глутамат усиливает горький и соленый вкус, в то время как сладкий вкус усиливается в наименьшей степени. Усиление вкуса других продуктов происходит за счет воздействия на глутаматные рецепторы языка. Регистрационный номер - E621. Представляет собой хорошо растворимый в воде белый кристаллический порошок, по форме и вкусу напоминающий поваренную соль. Вкус глутамата называется "umami" ("умами", так называемый "пятый вкус" - вкус белковой пищи). Глутамат натрия получают как из натуральных ресурсов, так и посредством химических реакций.

Характеристики и свойства, которыми обладает глутамат натрия:

высокая растворимость в воде;

низкая гигроскопичность;

отличная стабильность при высоких температурах и свете;

не влияет на цвет и на структуру пищевых продуктов;

внешний вид: мелкие кристаллы;

вкус: слегка соленый;

цвет: белый;

содержание: мин. 94%;

pH: 6,7-7,2;

соль: максимум 0,4%;

содержание натрия: макс. 12,3%;

срок хранения: 5 лет;

упаковка: мешки по 25кг.

Глутамат натрия всасывается и метаболизируется как обычная аминокислота. Поэтому качественный глутамат натрия, используемый в регламентированных дозах, не может вызывать никаких болезненных симптомов. Употребление технического, недостаточно очищенного глутамата натрия, вызывает мигрени, тошноту, сонливость, нарушение пищеварения, ускоренное сердцебиения, астму, и даже -- анафилактический шок. Отдельные исследователи убеждены, что патогенные примеси недоочищенного синтетического глутамата действуют непосредственно на кору головного мозга. Отсюда - ухудшение состояния больных бронхиальной астмой, заострение глаукомы и разрушение сетчатки глаз.

В сочетании с витамином Е глутамат натрия вызывает оксидативное повреждение клеток организма, при этом повреждая ДНК. При частом употреблении возможна постепенная утрата вкусовых ощущений из-за постепенного атрофирования вкусовых рецепторов.

Характеристика продуцента

В производстве соли монозамещенной глутаминовой кислоты используются штаммы бактерий, относящиеся к роду Coryn. Glutamicum. Принадлежит к группе аэробных бактерий с высоким содержанием гуанина и цитозина. Форма может быть разнообразной, но чаще встречаются вытянутые стержни с булавовидными концами. Быстрорастущая бактерия, не патогенная и не образует спор.

Царство: Bacteria

Тип:Actimobacteria

Класс:Actimobacteria

Семейство:Corynebacteriaceae

Род:Corynebacterium

Вид:C. glutamicum

Рис. 1: C. glutamicum под микроскопом

Рис. 2: Основные показатели культуры Corynebacterim glutamaticum при синтезе глутаминовой кислоты. 1-глюкоза, 2-кетоглутаровая кислота, 3-биомасса, 4-глутаминовая кислота.

Состав питательной среды

В качестве углеродного питания используют глюкозу, сахарозу, гидролизаты крахмала, мелассу, гирол. Кроме углеводов в качестве сырья могут быть использованы углеводороды (метан, этан, н-парафины нефти), а также уксусная, фумаровая кислоты и др.

В качестве источника азота используют мочевину в количестве 1,5 - 2,0%. Реже применяют как дополнительный к мочевине источник азота сульфат аммония (NH4)2SO4, хлорид аммония NH4Cl в количестве до 0,5% или водный раствор аммиака.

Для нормального роста культуры в среду необходимо вводить в десятых и сотых долях процента калий (в виде KH2PO4), магний (MgSO4*7Н2О), марганец (MnSO4*4H2O), а также мел.

Механизм биосинтеза

Процесс начинается с гидролиза сахарозы:

Фруктоза

Первой ферментативной реакцией гликолиза является фосфорилирование, т.е. перенос остатка ортофостфата на глюкозу за счет АТФ. Образование глюкозо-6-фосфата в гексокиназной реакции сопровождается освобождением значительного количества свободной энергии системы. Каталитическая активность фермента, гексокиназы, повышается в присутствии Mg2+. Переносчиком группы РО3Н2 является аденозинтрифосфат, который превращается в АДФ.

Второй рекцией является превращение глюкозо-6-фосфата под действием изомеразы во фруктозо-6-фосфат. Равновесная система состоит на 70-75% из фосфата глюкозы и на 30-25% из фосфата фруктозы.

Третья реакция катализируется ферментом фосфофруктокиназой; образовавшийся фруктозо-6-фосфат вновь фосфорилируется за счет второй молекулы АТФ:

Четвертую реакцию гликолиза катализирует фермент альдолаза. Под влиянием этого фермента происходит расщепление на две фосфотриозы:

Эта реакция обратима. В зависимости от температуры равновесие устанавливается на различном уровне. При повышении температуры реакция сдвигается в сторону большего образования триозофосфатов.

Пятая реакция - это реакция изомеризации триозофосфатов. Катализируется ферментом триозофосфатизомеразой:

В результате шестой реакции глицеральдегид-3-фофат в присутствии фермента дегидрогеназы, кофермента НАД и неорганического фосфата подвергается своеобразному окислению с образованием 1,3-биофосфоглицериновой кислоты и восстановленной формы НАД (НАДН):

1,3-Биофосфоглицерат представляет собой высокоэнергетическое соединение. Механизм действия дегидрогеназы сводится к следующему: в присутствии неорганического фосфата НАД+ выступает как акцептор водорода, отщепляющегося от глицеральдегид-3-фосфата. В процессе образования НАДН глицеральдегид-3-фосфат связывается с молекулой фермента за счет SН-групп последнего. Образовавшаяся связь богата энергией, но она непрочная и расщепляется под влиянием неорганического фосфата, при этом образуется 1,3-биофосфоглицериновая кислота.

Седьмая реакция катализируется фосфоглицераткиназой, при этом происходит передача богатого энергией фосфатного остатка на АДФ с образованием АТФ и 3-фосфоглицериновой кислоты:

Т.о., благодяря действию двух ферментов (глицеральдегидфосфатдегидрогеназы и фосфоглицераткиназы) энергия, высвобождающаяся при окислении альдегидной группы глицеральдегид-3-фосфата до карбоксильной группы, запасается в форме энергии АТФ. В отличие от окислительного фосфорилирования образование АТФ из высокоэнергетических соединений называется субстратным фосфорилированием.

Восьмая реакция сопровождается внутримолекулярным переносом оставшейся фосфатной группы, и 3-фосфоглицериновая кислота превращается в 2-фосфоглицериновую кислоту. Реакция легкообратима, протекает в присутствии ионов магния:

Девятая реакция катализируется ферментом енолазой, при этом 2-фосфоглицериновая кислота в результате отщепления молекулы воды переходит в фосфоенолпировиноградную кислоту, а фосфатная связь в положении 2 становится высокоэргической. Енолаза активируется катионами Mg2+ и Mn2+ и ингибируется фторидом.

Десятая реакция характеризуется разрывом выскоэргической связи и переносом фосфатного остатка от фосфоенолпирувата на АДФ. Катализируется ферментом пируваткиназой:

Для дествия пируваткиназы необходимы Mg2+ , а также одновалентные катионы щелочных металлов.

В результате одиннадцатой реакции пируват под влиянием пируваткарбоксилазы и при участии СО2 и АТФ карбоксилируется с образованием оксалоацетата:

Двенадцатая реакция катализируется ферментом цитрат-синтетазой, при этом ацетильная группа ацетил-КоА конденсируется с оксалоацетатом, в результате чего образуется лимонная кислота:

Ацетил-КоА Оксалоацетат Цитрат

Тринадцатая реакция - дегидратация лимонной кислоты с образованием цис-аконитовой кислоты, которая, присоединяя молекулу воды, переходит в изолимонную кислоту. Катализирует эти обратимые реакции гидратации-дегидратации фермент аконитатгидратаза. В результате происходит взаимоперемещение Н и ОН в молекуле цитрата:

В результате четырнадцатой реакции происходит образование б-кетоглутарата. Изоцитрат дегидрируется в присутствии НАД-зависимой изоцитратдегидрогеназы. В ходе реакции изоцитрат одновременно декарбоксилируется. НАД-зависимый фермент является аллостерическим ферментом, которому в качестве специфического активатора необходим АДФ. Кроме того, фермент для проявления своей активности нуждается в ионах Mg2+ и Mn2+. Происходит выделение CO2.

В ходе пятнадцатой реакции - ферментативного восстановительного аминирования б-кетоглутаровой кислоты НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназой - образуется глутаминовая кислота:

НООС - СН2 - СН2 - СО - СООН + НАД(Ф)Н2 + NН3 >

НООС - СН2 - СН2 - NН2СН - СООН + НАД(Ф).

В ходе рассмотренных реакций видно, что для нормального протекания синтеза глутамата необходимо наличие в субстрате неорганического фосфорного питания, а также макро- и микроэлементов К, Mg, Mn, активирующих ферменты.

Сверхсинтез кислоты у дикого штамма возможен в специальных физиологических условиях при торможении скорости роста и увеличении проницаемости клеточной мембраны для глутаминовой кислоты. Такие условия обеспечивает определенная концентрация биотина в среде (1 - 5 мкг/л), а также присутствие некоторых антибиотиков. Внутриклеточная концентрация глутамата снижается в результате экскреции продукта в околоклеточную среду, поэтому регуляция синтеза конечным продуктом ослабевает.

Также для осуществления процесса биосинтеза глутаминовой кислоты с высоким выходом используют мутанты с нарушенной ферментативной системой превращения кетоглутаровой кислоты в янтарную (отсутствие или дефект кетоглутаратдегидрогеназы).

Рис. 3: Схема синтеза глутаминовой кислоты C. Glutamaticum.

Шестнадцатая реакция - образование глутамата натрия. Для этого раствор глутаминовой кислоты нейтрализуют 45-50% раствором едкого натра.

Условия биосинтеза

На биосинтез глутамата оказывают стимулирующее влияние биотин, тиамин и некоторые антибиотики (пенициллин, тетрациклин), спирты и ПАВ. Однако концентрацию биостимуляторов следует строго контролировать, так как при высокой концентрации, например, биотина, усиливается рост биомассы, но снижается выход глутаминовой кислоты (рис. 4). Также при избытке биотина и недостаточной аэрации образуются аланин и молочная кислота, что связано с потерями углеводов.

Процесс биосинтеза осуществляют в строго асептических усло-виях в ферментаторах объемом 50 м3 с коэффициентом заполнения аппарата 0,7 в течение 48-52ч интенсивной аэрации. Температуру культивирования на всех стадиях поддерживают постоянной на уровне 28-30оС. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2.

Описание процесса биосинтеза

Синтез глутамата натрия осуществляется из глутаминовой кислоты, произведенной бактериями Coryn. Glutamicum.

Поскольку биосинтез глутаминовой кислоты предполагает высокую активность дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот, производственное культивирование должно проводится при интенсивной аэрации.

Воздух, подаваемый в ферментатор, выполняет несколько функций:

1) снабжает микроорганизмы кислородом

2) отводит газообразные продукты обмена

3) отводит теплоту, выделяемую микроорганизмами

4) создает однородность суспензии массы микроорганизмов

5) увеличивает скорость массопередачи и перемешивания жидкой среды.

На первом этапе происходит очистка атмосферного воздуха от пыли и его сжатие.

Атмосферный воздух поступает через фильтр предварительной очистки 1 в компрессор 2, где сжимается до необходимого давления (350-500кПа).

На втором этапе сжатый воздух необходимо поддерживать в оптимальном термодинамическом состоянии. При сжатии воздух нагревается до 100-200 градусов, поэтому его охлаждают в теплообменнике 3 до 25-30 градусов. При охлаждении сжатого воздуха конденсируется имеющаяся в атмосферном воздухе влага, которую отделяют во влагоотделителе 4. После отделения воды воздух нагревают до температуры культивирования микроорганизмов в теплообменнике-нагревателе 5. Далее воздух поступает в головной фильтр 6, где поддерживается его оптимальная температура и влажность. В этом фильтре происходит также и холодная стерилизация воздуха, так как вместе с частицами пыли отделяются и клетки микроорганизмов.

На третьем этапе осуществляется окончательная стерилизация воздуха в индивидуальном фильтре тонкой очистки.

Рис. 6: Технологическая схема приготовления посевного материала: 1-выращивания посевного материала в заводской лаборатории; 2-выращивание в инокуляторах объемом 2м3; 3- выращивание в инокуляторах объемом 5м3; 4- выращивание в биореакторах объемом 50м3.

Первая стадия (рис.6) выращивания посевного материала осуществляется в заводской лаборатории. Исходную культуру размножают на скошенной агаризованной среде в пробирке в стерильных условиях при оптимальных составе питательной среды и режиме выращивания (рН, температура, длительность).

Выращенную культуру стерильно смывают водой с поверхности агаризованной среды в колбы Эрленмейера вместимостью 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Для промышленных штаммов С. glutamicum питательные среды содержат следующие компоненты (в %):

Меласса 8

Кукурузный экстракт 0,3

Хлорид аммония 0,5

Калия фосфат двухзамещенный 0,05

Сульфат магния 0,03

Вода остальное

рН среды 7,0-7,2

Колбы с культурой помещают на качалку, которая находится в термостатируемом помещении. Продолжительность выращивания культуры в колбах на качалке составляет 24 ч. Эта стадия выращивания контролируется по морфологическим показателям микроорганизма. Наилучшие показатели дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости в конце логарифмической фазы роста.

На второй стадии выращивания посевного материала (рис.6) готовую культуру из колб стерильно переносят в посевной аппарат (инокулятор) объемом 2м3. Происходит накопление биомассы до 6-8 г АСВ на 1 л среды в аэробных условиях. Состав питательной среды такой же как и при выращивании в колбах Эрленмейера, но с добавление 0,1% стерильного синтетического пеногасителя. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2.

Третья стадия (рис.6) культивирования посевного материала повторяет вторую стадию, но процесс уже осуществляется в инокуляторах объемом 5м3. Для этого все содержимое малого инокулятора перекачивается в аппарат большего объема, в котором находится пострерилизованная питательная среда того же состава, что и использовалась на предыдущей стадии. Посевную культуру выращивают при температуре 28-32С в течение 18-24 ч и расходе воздуха 1 объем на 1 объем жидкости в 1 мин. В течение всего процесса рН среды поддерживается на уровне 7,0-7,2. По завершении процесса ферментации в посевных аппаратах культура не должна содержать фагов, посторонней микрофлоры и иметь титр около 109 клеток на 1 мл. Полученный посевной материал в количестве 5-6% (от объема среды производственных аппаратов) стерильно передают в основные ферментаторы.

Посевные аппараты на второй и третьей стадии оснащены мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования температуры, рН, уровня пены и т.д. Количество посевного материала, передаваемое в инокуляты, может варьировать в широких пределах от 1 до 20% по объему. Коэффициент заполнения посевного аппарата в зависимости от конструкции его отдельных узлов составляет 0,5-0,7. Перемешивание среды достигается либо в результате барботажа стерильного воздуха либо турбинной мешалкой со скоростью вращения 300об/мин.

Страницы: 1, 2



Реклама
В соцсетях
рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать рефераты скачать