Стерильная питательная среда (рис.8) в момент введения в биореактор имеет температуру, близкую к среде выращивания продуцента (28-30С), или около 80С. В последнем случае для достижения температуры проведения процесса культивирования жидкую фазу охлаждают подачей холодной воды в рубашку аппарата или в теплообменники, расположенные внутри самого ферментера.
Для промышленных штаммов С. glutamicum питательные среды на стадии биосинтеза содержат следующие компоненты (в %):
Меласса 20
Мочевина 2
Калия фосфат двухзамещенный 0,05
Сульфат магния 0,03
Вода остальное
рН 7,0-7,2
Дополнительно в питательную среду вводят мел до 1% и 0,1% синтетического пеногасителя. Мочевину вводят дробно, по мере потребления, чтобы содержание мочевины в среде не превышало 0,8%.
Посевной материал в количестве 5-10% от объема питательной среды поступает в ферментер. Коэффициент заполнения последнего составляет 0,7. Процесс ферментации продолжается при повышенном давлении 0,02-0,03 МПа, постоянной температуре 28-30С и контролируемом значении рН; периодически производится подача стерильного пеногасителя.
В первые сутки культивирования продуценты ассимилируют 25% углеводов и общего азота среды, в том числе почти все аминокислоты, в этот период образуется практически вся биомасса. Вторая стадия роста культуры сопровождается резким снижением скорости накопления биомассы и самыми высокими скоростями биосинтеза глутаминовой кислоты - 0,8-1,0 г/л*ч. Питательная среда сильно истощается, возможно значительное изменение рН раствора. На данном этапе осуществляют подтитровывание среды 25%-ным раствором аммиака. Последняя стадия культивирования может сопровождаться некоторой убылью биомассы за счет небольшого автолиза клеток и резким снижением скорости образования глутамата.
Контроль за ходом процесса биосинтеза осуществляют на разных этапах его проведения по оптической плотности раствора культуральной жидкости (по содержанию клеток продуцента), по содержанию субстрата в смеси или по сигналам датчиков рН и растворенного кислорода в ферментационной среде. К концу процесса биосинтеза готовая культуральная жидкость содержит до 50 г/л глутаминовой кислоты, концентрация оставшегося субстрата не более 0,5-1,0%. Выход глутаминовой кислоты по отношению к потребленным сахарам составляет 45-50%.
Количество накапливаемого глутамата удается повысить, если по мере исчерпания источников углерода и азота в среду по ходу процесса дополнительно вводить небольшие количества этих питательных веществ. Организация дробной «подпитки», общий объем которой не превышает 10% объема исходной жидкой фазы, приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление дробной «подпитки» позволяет увеличить концентрацию образующегося в культуральной жидкости глутамата до 60/л.
Рис. 7: Схема ферментатора со вспомогательными устройствами: 1 - корпус ферментатора, 2 - вал смесителя с турбинами, 3 - электродвигатель с коробкой передач, 4 - сальник вала смесителя, 5 - спираль теплообменника, 6 - перфорированный барботер, 7 - устройство для определения расходов воздуха, 8 - фильтр для стерилизации воздуха, 9 - воздушный клапан с регулировочным вентилем, 10 - уловитель, наполненный фенолом, 11 и 12 - резервуары для стерилизации пеногасителя и дополнительной подачи питательной среды во время ферментации, 13 - трубопровод для питательной среды, 14 - выводной вентиль, 15 - вентиль для отбора проб.
Рис. 8: Схема непрерывного приготовления питательной среды: 1 и 2 - резервуары для растворения исходных веществ, 3 - резервуар для смешивания растворов, 4 - насос для передачи среды, 5 - колонна или инжектор для нагрева среды паром, 6 - закрытый сосуд для стерилизации, 7 - охладитель, 8 - резервуар для спуска нагретой воды, 9 - ферментатор
Пятая стадия включает в себя предварительную обработку культуральной жидкости. Осуществляется в результате добавление к ней определенного количества негашеной извести с последующим осаждением избытка ионов кальция фосфорной кислотой. Образующийся при этом осадок способствует лучшему отделению клеток продуцента и других балластных примесей.
Шестая стадия - отделение осадка. Проводят центрифугированием или фильтрованием под давлением (рис.9). Осадок и отработанную биомассу - в отходы.
Рис. 9: Рамный фильтр-пресс: 1 - лобовина, 2 - рама, 3 - плита, 4 - брус, 5 - подвижная лобовина, 6 - гидравлическое устройство, 7 - прилив, 8 - кран.
Седьмая стадия - осветление фильтрата. Состоит в очистке его от пигментных примесей, окрашивающих нативный раствор в темный цвет. Для этого обрабатывают фильтрат активированным углем.
Восьмая стадия заключается в концентрировании осветленного раствора глутаминовой кислоты. Проводят путем его вакуум-выпаривания (рис.10) при температуре 40-60С, при этом из исходного раствора глутамата отгоняют от 50 до 80% воды.
Рис. 10: Выпарные аппараты: а - с центральной циркуляционной трубой, б - с выносной нагревательной камерой, 1 - корпус, 2 - нагревательные трубки, 3 - циркуляционная труба, 4 - сепаратор, 5 - отбойник.
Девятая стадия - кристаллизация. Осаждение кристаллов глутаминовой кислоты происходит в изоэлектрической точке. Эта стадия осуществляется путем подкисления полученного на предыдущем этапе концентрата соляной кислотой до рН 3,2 и охлаждения раствора до 4С. После кристаллизации содержание глутамата в продукте составляет 99,6%.
Десятая стадия - получение глутамата натрия. Кристаллы глутаминовой кислоты растворяют в воде, обрабатывают водный раствор активированным углем до полного обесцвечивания при температуре 60-70С. Затем раствор глутаминовой кислоты нейтрализуют 45-50%-ным раствором NaOH до рН 6,8, после чего фильтруют. Фильтрат упаривают на вакуум-выпарной установке при 40-50С, а затем охлаждают. Кристаллизация проводится в течение 3 суток, при плавном снижении температуры. Кристаллы глутамата натрия отделяют от маточного раствора на центрифуге и высушивают нагретым воздухом. Содержание основного вещества в готовом продукте составляет 98%.
Выделение продукта
Упаренный фильтрат нейтрализованной глутаминовой кислоты постепенно охлаждают в течение 3 суток. Вследствие этого образуются кристаллы глутамата натрия. Их отделяют от маточного раствора на центрифуге и высушивают нагретым воздухом. Содержание основного вещества в готовом продукте составляет 98%.
Центрифуга периодического действия (рис. 11), в которых неоднородная смесь (например, суспензия) вводится в центральную часть полого ротора во время его вращения; твёрдые частицы оседают на внутренней поверхности ротора, а осветлённая жидкость (фугат) отводится из верхней его части. Образовавшийся осадок выгружается из ротора после его остановки (в некоторых случаях на ходу) через специальные сопла или через периодически открывающиеся щели (отверстия).
Рис. 11: Центрифуга: 1 - ротор, 2 - выгружающий шнек, 3 - подвод суспензии, 4 - отвод фугата, 5 - выгрузка осадка.
Основной частью сушилок являются медленно вращающиеся (2--10 об/мин) вальцы, в которые через полую цапфу поступает греющий пар и от них отводится конденсат. Высушиваемый материал поступает на вальцы, налипает на их поверхности тонким слоем, высушивается и срезается ножом.
Рис. 12: Вакуум-сушилки: а - одновальцовая, б - двухвальцовая. 1 - полый барабан (валец), 2 - корпус, 3 - корыто, 4 - распределительный валик, 5 - нож, 6 - шнек, 7 - приемный колпак, 8 - сборник, 9 - вальцы, 10 - наклонные стенки.
Активаторы и ингибиторы процесса
Для получения глутаминовой кислоты и для интенсивного ее накопления необходим кислород, т.е. необходима аэрация питательной среды. В условиях недостаточной аэрации активируется аланиндегидрогеназа, катализирующая образование аланина из пировиноградной кислоты, и лактатдегидрогеназа, превращающая пируват в молочную кислоту. Аланин и лактат приводят к снижению выхода глутамата. Слишком интенсивная аэрация способствует усиленному росту биомассы, выход глутамата при этом также снижается. Поэтому количество растворенного в жидкой фазе кислорода необходимо поддерживать на оптимальном уровне.
Важным фактором является соблюдение температурного режима и режима рН среды для того, чтобы поддерживать оптимальные условия для всего процесса бисинтеза, а также для избавления от посторонней микрофлоры.
Большую роль играют витамины, они являются коферментами многих ферментов. Все продуценты глутаминовой кислоты биотинзависимые, однако содержание биотина регламентировано и не должно превышать 2-5 мкг на 1 л среды. Более высокая концентрация этого витамина излишне стимулирует рост клеток продуцента, способствует повышенному образованию аланина, молочной, янтарной, аспарагиновой кислот, а выход глутамата при этом значительно снижается.
Рис.4: Зависимость между образование глутамата у C. Glutamicum и содержанием биотина в среде.
Ингибирующее влияние биотина удается снизить при включении в состав питательных сред различных добавок в виде некоторых спиртов, ПАВ, антибиотиков (пенициллинов, тетрациклинов). Добавки в среду ПАВ в количестве 0,01-0,2% или калиевой соли бензилпенициллина (4-6 тыс. ед. на 1 л среды) повышают биосинтетическую способность продуцента на 15-45%. Действие антибиотиков связано с ингибированием синтеза липогликопротеинового комплекса клеточной оболочки продуцента, что приводит к увеличению проницаемости клеточных мембран для глутаминовой кислоты.
Возможности генной инженерии
В последние годы для получения новых эффективных штаммов- продуцентов аминокислот стали применять новейшие методы биотехнологии. Методы генетической инженерии позволяют повышать количество генов биосинтеза путем их клонирования на плазмидах. Это приводит к увеличению количества ферментов, ответственных за синтез аминокислот, следовательно, повышает выход целевого продукта. Клонирование генов системы синтеза аминокислот в клетки микроорганизмов с иным, по сравнению с донорским организмом, типом питания позволяет расширять сырьевую базу и заменять дорогостоящие сахаросодержащие субстраты более дешевыми.
Технология рекомбинантных ДНК представляет собой изменение с помощью биохимических и генетических методик хромосомного материала - основного наследственного вещества клеток. Хромосомный материал состоит из дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Биологи изолируют те или иные участки ДНК, соединяют их в новых комбинациях и переносят из одной клетки в другую. В результате удается осуществить такие изменения генома, которые естественным путем вряд ли могли бы возникнуть.
Эта технология основана на следующем принципе: помимо своей собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК, называемые плазмидами.
Плазмиды реплицируются автономо и сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам или контролирующие синтез веществ.
Плазмидную ДНК можно выделить и ращепить подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами.
Фрагменты любой чужеродной ДНК с такими же липкими концами (полученными после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидой ДНК с помощью лигазы. Рекомбинантную конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплицируется (рис. 5).
Рис. 5: Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду с использованием эндонуклеазы.
Штаммы - суперпродуценты, используемые в производстве, как правило, получены с использованием методов селекции и генетики. Получены микробы - суперпродуценты из родов Brevibacterium, Corynebacterium, Microccocus и другие,с помощью которых освоено крупнотоннажное производство глутамата и других аминокислот.
Известны продуценты L-глютаминовой кислоты Corynebacterium glutamicum с высокой супероксидисмутазной активностью (патент Японии 5-29436 C 12 P 13/14), продуцирующие до 100 г/л глютаминовой кислоты, получен мутант Corynebacterium glutamicum, содержащий рекомбинантную ДНК с фрагментом, несущим ген, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксилазу из Escherichia coli (патент Японии 4-17639 C 12 P 13/14). Основным недостатком всех вышеперечисленных штаммов и мутантов является непродуктивный расход углеродсодержащих субстратов на биосинтез молочной кислоты, при этом при культивировании всех приведенных штаммов выход глютаминовой кислоты от субстратов составлял не более 56%.
Новый штамм бактерий Corynebacterium glutamicum был получен мутацией штамма АТСС 4128. Клетки исходного штамма подвергали УФ-мутагенному воздействию. Отбор проводили с помощью биоавтографического метода. Бактериальные клетки, выросшие на чашках, убивали УФ-облучением, после этого чашки заливали агаризованной средой, содержащей суспензию клеток штамма, нуждающегося в L-глутаминовой кислоте. Рост такой индикаторной бактерии подтверждал выделение исследуемым штаммом L-глютаминовой кислоты. Прямой отбор среди 100 вариантов, полученных после обработки клеток исходного штамма АТСС 4128, позволил выявить 8 штаммов, обладающих способностью к синтезу L-глютаминовой кислоты, далее мутанты отбирались по двум признакам: резистентности к Na-триевой соли ампициллина и выходу от поданного углеродсодержащего субстрата более 60%. При выращивании на жидкой синтетической питательной среде с добавлением источников N, P, K, Na, Mg, биотина, тиамина, содержащей сахарозу в количестве 40 г/л, был отобран штамм ВСБ-206л, способный к сверхсинтезу L-глютаминовой кислоты с выходом от потребленной сахарозы 63%. Штамм Corynebacterium glutamicum (ВСБ-206л) депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Государственного научно-исследовательского института генетики под номером B-7198. Физиолого-биохимические признаки: ассимилирует глюкозу, сахарозу, ацетат, этиловый спирт. Нуждается в добавках биотина, тиамина, способны к сверхсинтезу L-глютаминовой кислоты, обладает пониженной активностью лактатдегидрогеназы, что снижает затраты углерода субстрата на жизнедеятельность бактерий, уменьшает непродуктивный расход углерода на биосинтез молочной кислоты.
Технологические усовершенствования
К эффективным методам улучшения процесса относится метод подпитки. К периодической культуре добавляются компоненты питания - обычно соединения углерода, по мере его исчерпывания. Культура не страдает от избытка углерода в начале роста, что неизбежно в периодической культуре. Поэтому после подпитки сразу начинается бурный рост культуры, который идет с постоянной скоростью до полного исчерпывания всех компонентов питания.
Технологические усовершенствования могут касаться и конструкций используемого оборудования. Следует заменить внутренние змеевиковые теплообменники на плоские ламельные теплообменники, выполняющие одновременно роль отражательных перегородок, либо на высокоэффективные внешние. Возможно осуществить возврат к уплотнениям вала мешалки сальникового типа. Это обусловлено сложностью эксплуатации торцевых уплотнений, с другой стороны, появлением новых уплотняющих материалов, позволяющих создать более грамотные сальниковые уплотнения. Необходимо использование перемешивающих устройств большой мощности с плавным или ступенчатым регулированием числа оборотов. Наиболее эффективный привод с мощностью 2,5 кВт/м3. Во время культивирования меняются реологические свойства и потребность продуцента в кислороде, поэтому очень важно иметь привод с регулируемым числом оборотов мешалки. Максимальный расход мощности требуется в первые двое суток культивирования. При проектировании новых предприятий нужно предусматривать возможность понижения расхода снижением числа оборотов мешалки, а также изменения геометрии самой мешалки за счет сдвига лопастей к диску. Этим достигается экономия энергии, максимально обеспечиваются потребности культуры в кислороде. Для эффективности перемешивания среды кислород следует подавать через барботеры.
3)В промышленности глутаминовую кислоту можно получить и другими способами: многостадийным химическим синтезом из акрилонитрила и микробиологическим по двухступенчатой технологии, выделением из свекловичной мелассы или из белковых гидролизатов.
Двухступенчатый способ получения. Его можно осуществить из б-кетоглутаровой кислоты с помощью ферментов трансамилазы или глутаматдегидрогеназы в результате следующих превращений:
1 вариант - переаминирование кислот (фермент - трансамидаза)
б-кетоглутаровая кислота + а/к > L-глутаминовая кислота + б-кетокислота;
2 вариант - восстановительное аминирование (фермент - глутаматдегидрогеназа)
б-кетоглутаровая кислота + NH4+ + НАДН > L-глутаминовая кислота + Н2О + НАД+
В каждом из этих процессов б-кетоглутаровая кислота играет роль предшественника.
Для осуществления любого из этих превращений необходимы источники б-кетоглутарата и соответствующей ферментной системы. Первую из этих задач решают с помощью подбора м/о, способных продуцировать значительное количество б-кетоглутаровой кислоты из доступных источников сырья. Продуцентами б-кетоглутарата могут быть Pseudumonas и Escherichia, а при культивировании продуцента Kluyverd citrophila б-кетоглутаровая кислота была получена с 57%-ным выходом. Дрожжи рода Candida при выращивании на н-парафинах продуцируют б-кетоглутарат совместно с пируватом в соотношении 6:1. Экономический коэффициент процесса биосинтеза достигает 90% от количества потребленных углеводородов.
В роли продуцента фермента трансамидазы могут выступать различные м/о, например E. Coli. Донором аминогрупп может быть аспарагиновая кислота или аланин.
Восстановительное аминирование возможно осуществить с помощью Pseudomonas или Aeromonas, причем некоторые штаммы этих м/о в качестве субстрата могут использовать D,L-б-оксиглутаровую кислоты, производимую химическим синтезом.
В последние годы внимание исследователей привлекают методы получения аминокислот с использованием иммобилизованных ферментов. Способ имеет ряд преимуществ, в частности, конечный продукт отличается высокой концентрацией и чистотой, нет опасности заражения в ходе реакции посторонними микроорганизмами, в результате синтеза образуются только природные изомеры, имеется возможность осуществления непрерывных технологических процессов.
Микроорганизмы являются основными источниками ферментов, переводимых в иммобилизованную форму. Имея в виду преимущества иммобилизованных ферментов, необходимо учитывать, что они всегда будут дороже растворимых, но их внедрение экономически оправдано при удовлетворении даже одного из приводимых ниже условий: повышение стабильности фермента, обеспечивающее его многократное применение и тем самым сокращение расходов на препарат; улучшение качества продукта благодаря отсутствию в нем следов фермента и предотвращению нежелательных побочных реакций.
Выход продукта
Организация «дробной» подпитки приводит к активизации биосинтетической деятельности микроорганизмов. На мелассной среде осуществление «дробной» подпитки позволяет увеличить выход до 60 г/л. Количество фосфора в среде должно быть в пределах 8-20 мг %. Увеличение данной концентрации на один порядок почти на половину снижает выход глутамата. Повышение оптимальной температуры культивирования на 5о приводит к быстрому автолизу клеток, и в среде накапливается меньше глутамата. Недостаточная аэрация приводит к образованию аланина и лактата за счет снижения выхода глутамата. Слишком интенсивная аэрация способствует усиленному росту биомассы, выход целевого продукта при этом также начинает снижаться.
При использовании в качестве продуцента бактерий Micrococcus glutamicus и при оптимальных условиях культивирования выход целевого продукта составляет примерно 45 г в 1 л среды. Культура Microbacterium ammoniophilum на среде с тростниковой мелассой дала выход глутаминовой кислоты более 70 г/л. Corynebacterium glutamicum 7198 накапливает до 100 г/л глутаминовой кислоты.
Чем больше синтезируется продуцентом глутаминовой кислоты, тем больше образуется глутамата натрия при дальнейших превращениях глутамата.
Определение стехиометрических коэффициентов и теплового эффекта реакции
Общее стехиометрическое уравнение для аэробного процесса выглядит следующим образом:
s*[C12H22O11] + O2*[O2] + N*[NH4Cl]=[X] + p*[p] + CO2 *[CO2 ] + H2O* [H2O],
где s,O2,N,p,CO2 ,H2O - стехиометрические коэффициенты для субстрата, кислорода, азота, продукта, углекислого газа и воды соответственно.
[C12H22O11], [O2], [NH4Cl], [X], [p], [CO2], [H2O] - концентрации субстрата, кислорода, мочевины, продукта реакции, углекислого газа, воды
1. Для определения s,p приведем все количества к 1 С-молю биомассы
Для биомассы Х используем формулу Стоухамера CH1,8N0,5O0,2
На 280 г сухого вещества биомассы выделяется 380 г продукта. В качестве углеродного субстрата используется 2 кг мелассы. Меласса содержит 50% сахарозы, следовательно сахарозы в ней содержится 1кг. Запишем полученное уравнение:
1000/342 [C12H22O11] = 280/24,6 [X] + 380/147 [C5H9NO4]
2,92/11,38 [C12H22O11] = 11,38/11,38 [X] + 2,59/11,38 [C5H9NO4]
0,26 C12H22O11] = [X] + 0,23 [C5H9NO4]
s= 0,26, p= 0,23
2. Для определения коэффициентов по другим веществам необходимо составить систему уравнений элементарного баланса:
С: s*mS = 1 + p*mp + CO2;
H: s*nS + NH4Cl*4 = 1,8 + p*np + H2O* 2;
O: s*pS + O2*2 = 0,5 + p*pp + H2O +CO2*2;
N: s*qS + NH4Cl = 0,2 + p*qp.
s=0.26, p= 0.23
ms=12, mp= 5
ns=22, np= 9
ps=11, pp= 4
qs=0, qp=1.
С: 0.26*12 = 1 + 0.23*5 + CO2 => CO2=1.97
H: 0.26*22 + NH4Cl*4 = 1,8 + 0.23*9 + H2O* 2
N: NH4Cl = 0,2 + 0.23*1=> NH4Cl = 0.43
O: 0.26*11 + O2*2 = 0,5 + 0.23*4 + CO2 *2 + H2O
H2O = 1.785
O2 = 2.145
Полученное уравнение:
0.26* [C12H22O11] + 2.145*[O2] +0.43*[ NH4Cl] = [X] + 0.23*[C5H9NO4]+ 1.97 *[CO2 ] + 1.785* [H2O],
Список используемой литературы
1) Яковлев В.И. Технология микробиологического синтеза. - Л.: Химия, 1987
2) Биотехнология: Учеб. пособие для вузов. В 8 кн./Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова. Кн. 6: Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов / Быков В.А., Крылов И.А., Манаков М.Н. и др. - М.: Высш. шк., 1987. - 143с.: ил.
3) Биотехнология / Т.Г. Волова. - Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - 252 с.
4) Бекер М.Е. Введение в биотехнологию. - Изд-во «Пищевая промышленность», 1978. - 238 с.
Страницы: 1, 2
