Распространение микроорганизмов рода Clostridium в природе и пищевых продуктах
54
ФГОУ ВПО «Астраханский Государственный Технический Университет»
Кафедра «Прикладная биология и микробиология»Курсовая работана тему: «Распространение микроорганизмов рода Clostridium в природе и пищевых продуктах» Астрахань, 2007 СодержаниеВведениеГлава 11. Характеристика рода Clostridium1.2 Патогенные микроорганизмы рода Clostridium1.2.1 Возбудитель ботулизма1.2.2 Clostridium perfringens1.2.3 Возбудитель эмфизематозного карбункула1.2.4 Возбудитель столбняка1.3 Значение микроорганизмов рода Clostridium в промышленности1.3.1 Возбудители порчи баночных консервов
1.3.2 Получение ацетона и бутанола в ходе бактериального брожения представителей рода Сlostridium
1.4 Применение ботулинического токсина в медицине
Глава 2 Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследования
2.2 Выявление мезофильных анаэробных микроорганизмов
2.3 Выявление термофильных анаэробных микроорганизмов
2.4 Выявление возбудителей брожения пектиновых
2.5 Выявление возбудителей брожения целлюлозы
2.6 Выявление анаэробных азотфиксирующих микроорганизмов, вызывающих маслянокислое брожение
3. Выделение бактерий рода Clostridium из разных объектов
3.1 Результаты посевов в жидкую среду Китт-Тароцци для выявления мезофильных и термофильных анаэробных микроорганизмов
3.2 Результаты посевов для выявления возбудителей брожения пектиновых веществ
3.3 Результаты посевов в жидкую среду Омелянского для выявления возбудителей брожения целлюлозы
3.4 Результаты посевов на жидкую среду Виноградского
Выводы
Список литературы
Приложение
Введение
С жизнедеятельностью клостридий связаны различные процессы, протекающие в природе: разложение (гниение) азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот) в анаэробных условиях; анаэробное разложение растительных материалов, таких как клетчатка, хитин. Еще в конце ХIX века было обнаружено, что некоторые клостридии патогенны, т. е. вызывают заболевания человека и животных. В основе патогенности клостридий лежит их способность синтезировать и выделять из клетки высокоэффективные токсины.
Некоторые бактерии рода Clostridium входят в состав нормальной микрофлоры ЖКТ и женских половых путей; иногда их обнаруживают на коже и в полости рта. Из материала, полученного от больных людей, выделены, по крайней мере, 30 видов клостридий. Подобно некоторым другим патогенным анаэробам, клостридии на воздухе не гибнут, но на питательных средах в присутствии кислорода не растут. Для бактерий этого рода характерно обильное выделение газа при культивировании и субтерминальное расположение спор (Ассонов, 1989).
Бактерии группы Clostridium находят и практическое применение. Их используют в производстве масляной кислоты, необходимой для парфюмерной промышленности. Ацетонобутиловое брожение, осуществляемое некоторыми видами клостридий, используют для получения в промышленном масштабе ацетона и бутанола (Воробьева, 1989).
Целью данной курсовой работы является изучение бактерии рода Clostridium, выделенных из различных сред их обитания.
Были поставлены следующие задачи:
1. Выявление из разных типов почв азотфиксирующих микроорганизмов рода Clostridium.
2. Выявление из разных типов почв микроорганизмов рода Clostridium, участвующих в маслянокислом брожении.
3. Выявление из разных типов почв микроорганизмов рода Clostridium, участвующих в брожение целлюлозы.
4. Выявление микроорганизмов рода Clostridium, из волокон растений и вызывающих брожение пектиновых веществ.
5. Выявление мезофильных и термофильных микроорганизмов рода Clostridium из пищевых продуктов.
Глава 1
1. Характеристика рода Clostridium
Бактерии рода Clostridium, грамположительные спорообразующие облигатные анаэробы, повсеместно распространены в природе. Этот род насчитывает более 60 видов, многие из которых являются сапрофитами. Некоторые сахаролитические клостридии могут использовать в качестве субстрата брожения пектиновые вещества, составляющие покровы растительных клеток. Клостридии, принадлежащие к виду Сl. felsineum, содержат активную пектиназу и могут поэтому получать энергию, осуществляя маслянокислое брожение пектиновых веществ. Этот вид играет важную роль в процессе мацерации волокон при мочке льна.
К роду Clostridium относятся микроорганизмы, не использующие в качестве акцептора водорода молекулярный кислород воздуха. Некоторые из них могут развиваться при пониженном парциальном давлении кислорода. Оптимальными значениями окислительно-восстановительного потенциала среды для их развития являются Eh от 50 до 200 млВ. Клостридии не обладают каталазообразующей способностью.
Микроорганизмы рода Clostridium широко распространены в природе. Один из самых распространенных видов - Clostridium perfringens. Эта бактерия неподвижна, имеет капсулу и на питательных средах споры образует редко. При кипячении споры гибнут. В состав нормальной микрофлоры толстой кишки входит более 30 видов клостридий. В 1 г кала их содержится 10 в степени 9-10. Clostridium ramosum по распространенности немногим уступает Cl. perfringens. Эти два вида повсеместно обнаруживаются в почве, где их концентрация достигает 10000 1/г. Клостридии грамположительны, но в материале, полученном от больных, а также в стареющих культурах нередко бывают грамотрицательными. Поэтому результаты микроскопии окрашенных по Граму мазков следует оценивать с осторожностью.
Многие из них являются постоянными обитателями почвы [Е.Н. Мишустин, М.И. Перцовская и др. (1979); Г.В.Меренюк, Г.И. Пономаренко (1979)]. Вместе с почвой, оставшейся на сырье, клостридии попадают в процессе производства в готовые продукты -- сухие картофельные и овощные.
Л.Е. Прохорович, Л.А. Салтыкова и др. (1975), Н.Н. Мазохина-Поршнякова, Л.П. Найденова (1977) сообщают о высокой обсемененности корнеплодов клостридиями.
И.Я. Овруцкая, В.Е. Новицкая (1983) обнаружили анаэробы рода Clostridium на сыром картофеле и овощах, на полуфабрикатах, в сухом картофельном пюре, сушеном картофеле и овощах.
Клетки имеют форму палочек различной длины и ширины. Длина клостридиальных клеток зависит от условий культивирования и фазы развития.
Расположение клеток в препарате иногда можно использовать как диагностический признак. Так, клетки Сl. perfringens могут располагаться параллельно одна другой, клетки Сl. beijerinkii слабо изогнуты.
Клостридии в основном подвижны, кроме Сl. perfringens. Способность к спорообразованию у них неодинакова: Сl. sporogenes хорошо образует споры (85--90% клеток дают споры), Сl. perfringens на обычных питательных средах, как правило, спор не дает, но иногда все же встречаются единичные споры, остальные клостридии в этом отношении занимают промежуточное положение.
В таблице 1 приведены дифференциальные признаки микроорганизмов рода Clostridium.
Таблица 1
Дифференциальные признаки микроорганизмов рода Clostridium
Вид бацилл | Форма и размеры колоний в анеэробных условиях | Размер клеток, мкм | споры | Общие свойства | Рост на среде Китт- Тароции | Рост на лакмусовом молоке | Температура роста, С0 | Образование токсина | |||
форма | раздутость | Располо- жение | |||||||||
С. botulinum типа А и В | На поверхности агара -- круглые колонии диаметром 3-- 8 мм, плоские, серого цвета, с уплотненным центром и ризоидны ми краями. Поверхность матовая, в глубине агара -- колонии в виде комка ваты, белого цвета, диаметром 5--10 мм | 0,8--1,3Х X 4,4--8,6 | 0 | + | СТ | Строгие анаэробы грамположительные в молодой культуре, ка- талазоположнтельные, в основном подвижные, обладают суль-фитредуцнрующей способностью, индол не образуют, ферментируют глюкозу, мальтозу, сахарозу. Не ферментируют манит, рамнозу, сорбит. Разжижают желатин | Помутнение среды и газообразование через 18--24 ч. Размягчение кусочков мяса, образование облаковидного осадка | Пентонизируют, не коагулируют | 30-40 | + | |
С, beijerinkii | В глубине агара -- колонии шаровидные, с гладкой поверхностью, белого или кремового цвета, диаметром 2,5--3,0 мм | 03--1,5Х Х3,0-7,5 | 0 | + | ЭКС до СТ | Помутнение среды, умеренное газообразование через 14--18 ч | Коагулируют, слабо фраг-ментируют, не пептонизируют | 25-30 | - |
Продолжение таблицы 1
С. pasteu-rianum | В глубине агара -- колонии мелкие, в виде двояковыпуклых линз, слегка опушенные, диаметром 1,0-- 1,5 мм | 0,5--0,8Х Х3,4-13,2 | 0 | + | СТ | То же | Помутнение среды, сильное газообразование через 8-- 14 ч. | Не изменяют | 25-37 | - |
С. butyri-cum | В глубине агара -- колонии двояковыпуклые, плотные, желто-белые, диаметром 3,0--5,0 мм | 0,6--1,2Х X 3,0-7,0 | 0 | + | ЭКС до СТ | Строгие анаэробы, подвижные, грамположительные в молодой культуре, каталазоот-эицательные, не разжижают желатин, сероводород и индол не образуют. Ферментиуют галактозу, глюкозу, рафинозу, саха-эозу, фруктозу. Не рерментируют дульцит, рамнозу | Помутнение среды, обильное газообразование, запах масляной кислоты через 8-- 14 ч. Рост слабый при отсутствии глюкозы | Бурная ферментация, фраг-ментированное свертывание, не пептонизируют | 25-37 | - |
Принятые сокращения: СТ - субтерминальное расположение; ЭКС - эксцентральное расположение, Э - эллиптические или цилиндрические; Ц -центральное; Т - терминальное и субтерминальное; ЦТ - расположение от центрального до терминального; «+» положительная реакция; «-» отрицательная реакция.
Споры в клетках расположены субтерминально, у Сl. beijerinkii и С. butyricum иногда наблюдается эксцентральное расположение спор. Споры у всех клостридии, за исключением Сl. perfringens, раздувают клетку; в зависимости от формы и расположения споры клетка приобретает вид теннисной ракетки (Сl. botulinum, Сl. sporogenes), веретена или сигары (Сl. beijerinkii, Сl. pasteurianum, Сl. butyricum).
Споры всех клостридий устойчивы к действию многих химических веществ и высокой температуры, а также к высушиванию.
Характер роста активно развивающихся вегетативных клеток на жидких мясных средах может служить дифференциальным признаком. Сl. perfringens обладает короткой лаг-фазой, максимум роста наступает через 4--6 ч. Остальные виды обладают более длительной лаг-фазой и максимум роста у них наблюдается через 18--24 ч.
Все представленные клостридий растут на среде Китт-Тароцци с помутнением среды и газообразованием, но рост Сl. perfringens и Сl. sporogenes сопровождается обильным газообразованием, а Сl. pasteurianum и Сl. butyricum не растут на этих средах в отсутствии глюкозы.
По биохимическим особенностям клостридий разделены на две группы. В первую входят Сl. botulinum типов А и В, Сl. perfringens типа А, Сl. sporogenes, разжижающие желатин, во вторую группу -- Сl. pasteurianum, Сl. butyricum, Сl. beijerinkii, не разжижающие желатин.
Внутри этих групп имеются клостридий, обладающие хорошо выраженными сахаролитическими свойствами (Сl. butyricum, Сl. pasteurianum, Сl. beijerinkii) и клостридий, обладающие незначительной сахаролитической активностью (Сl. sporogenes, Сl. botulinum типа А), а также клостридий, занимающие промежуточное положение по этому признаку (Сl. botulinum типа В, Сl. perfnngens).
Одним из признаков является характер роста клостридий на лакмусовом молоке. Сl. perfringens и Сl. butyricum бурно сбраживают молоко, процесс сопровождается отделением сгустка от сыворотки. В посевах Сl. perfringens сыворотка осветляется, а в посевах Сl. butyricum остается мутной. Рост Сl. perfringens на этой среде происходит при температуре 47°С за 4--5 ч, при 37°С -- за 6--8 ч.
Рост Сl. butyricum происходит только при 37°С за 18--20 ч. Сl. sporogenes и Сl. botulinum свертывают молоко и пептонизируют при 37°С, а Сl. pasteurianum и Сl. beijerinkii молоко не свертывают или свертывают не по всему столбику, лакмус редуцируется.
Из клостридий, встречающихся в сухих картофельных и овощных продуктах, Сl. botulinum и Сl. perfringens образуют токсины, опасные для человека.
Этот признак для Сl. botulinum является постоянным, поэтому при идентификации целесообразно использовать метод постановки биологической пробы, основанный на нейтрализации токсина ботулизма противоботулинической сывороткой соответствующего типа.
Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические особенности анаэробных бактерий рода Clostridium лежат в основе выделения и идентификации этих микроорганизмов из различных объектов исследования, в том числе из сырья, полуфабрикатов сухих и кулинарно подготовленных картофельных и овощных продуктов (Овруцкая,1983).
Clostridium pasteurianum способен активно фиксировать азот. Это облигатно анаэробная крупная споровая палочка, подвижная в молодом состоянии, в заключении цикла развития образует споры. При образовании споры клетка раздувается в виде веретена и наполняется резервным крахмалоподобным веществом - гранулезой. Это вещество синеет при воздействии раствором йода в йодистом калии. Cl. pasteurianum живет за счет сбраживания сахаров с образованием масляной и уксусной кислот и газов СО2 и Н2 ; нуждается в витаминах. На среде Виноградского быстро вырождается, теряя способность к спорообразованию, а потом и к росту.
Получить Cl. pasteurianum в чистом виде трудно, так как он живет в довольно тесном симбиозе с аэробной споровой палочкой Bacillus closteroides. Этот спутник ограждает анаэроба от кислорода воздуха, перехватывая его на свои нужды и снабжает его необходимыми витаминами, а сам получает азотистое питание от азотфиксатора. Чистая культура может быть получена из накопительной при получении изолированных колоний на твердой среде. Это может быть среда Виноградского с добавлением автолизата дрожжей. Колонии Cl. pasteurianum вырастают только в эксикаторе, из которого выкачан воздух до остаточного давления 5-10 мм, так как Cl. pasteurianum облигатный анаэроб и не может расти на поверхности твердых сред на воздухе. Чистая культура хорошо развивается на среде Виноградского с добавлением автолизата дрожжей и загущенной небольшим количеством агара для создания более анаэробных условий вследствие замедления диффузии кислорода воздуха (Работнова, 1966).
Азотфиксация интенсивнее происходит на безазотистой среде. Если в среде имеется азот, особенно аммонийный, то азотфиксация ослабевает или совсем прекращается. Cl. pasteurianum живет в широком диапазоне рН от 4,5 до 9,0 .Фиксирует 10-20 мг азота на 1 г сброженного сахара. В более слабой степени, чем Cl. pasteurianum, способностью к азотфиксации обладает вся обширная группа Clostridium. Это было доказано Вильсоном методом с применением N15 у 15 видов этого рода.
Cl. pasteurianum распостранен очень широко. Он встречается практически во всех почвах, в виде палочек или спор. Но в наибольшем числе и в наиболее активном состоянии Cl. pasteurianum находится в ризосфере растений. Этот микроб сожительствует с растениями, снабжая их азотом и получая от них органические вещества и витамины.
Интересно, что этот облигатный анаэроб обитает главным образом в верхних слоях почвы, наиболее богатых органическими веществами, пронизанных корнями растений. Кислород воздуха ему не вредит, так как Cl. pasteurianum живет под защитой аэробов, перехватывающих кислород воздуха и не допускающих его до анаэроба (Емцев, 1966).
Clostridium perfringens является санитарно-показательным микроорганизмом., так как эти бактерии обитают в кишечнике теплокровных животных и человека. Обнаружение Cl. perfringens свидетельствует о некогда имевшем место фекальном загрязнение (эти бактерии образуют споры, что позволяет им длительно сохранятся в окружающей среде). В отечественной практике количественный учет клостридий предусмотрен при исследованиях почвы, лечебных грязей, воды открытых водоемов. Определение этого микроорганизма проводят и в некоторых пищевых продуктах, но уже как возбудителя пищевых отравлений.
При санитарно-микробиологическом исследовании почвы учитывают комплекс показателей, среди которых такой как перфрингенс-титр. Для определения перфрингенс-титра пользуются разведениями почвенной взвеси (чистую почву засевают в разведении 10-1 - 10-3, загрязненную от 10-4 до 10-5). По 1 мл из выбранных разведений засевают в пробирки с 5 мл стерильного обезжиренного молока или железосульфитной средой Вильсона-Блера. Посевы инкубируют при 43°С в течение 24-48 ч, после чего учитывают результаты по характерному свертыванию молока (образование губчатого сгустка в верхней части пробирки и просветление сыворотки) или по образованию колоний Clostridium perfringens в агаровом столбике среды Вильсона-Блера (колонии черного цвета различной интенсивной окраски, имеющие форму двояковыпуклой линзы, комочка ваты или «самолетика»). Из колоний делают мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют и вычисляют перфрингенс-титр. Клетки Cl. perfringens - подвижные (реже неподвижные) короткие толстые палочки с закругленными концами. Образуют овальные или круглые эндоспоры, расположенные центрально и придающие клеткам веретенообразную форму ()споры также могут располагаться терминально или субтерминально). В мазках расположены одиночно, попарно, в виде цепочек или параллельно друг к другу, грамположительны, каталазоотрицательны. Предельное разведение почвенной суспензии, которое дает на молочной среде размножение Cl. perfringens, означает титр этого микроорганизма в почве. Для чистой воды перфрингенс-титр составляет 0,01 и выше, для загрязненной - 0,009-0,0001, для сильно загрязненной - 0,0009 и ниже (Нетрусов, 2005).
