1.2.1 Возбудитель ботулизма
Ботулизм вызывает Clostridium botulinum, это тяжелое пищевое бактериальное отравление с преимущественным поражением центральной нервной системы и высокой летальностью. Возбудитель болезни открыт в Голландии Э. ван Эрменгемом в 1896 г. Временной интервал между попаданием токсина в организм и появления первых признаков ботулизма, обычно не превышает 24 ч, но может варьировать от 4-6 до 96 часов и более. Ботулизм связан, главным образом, с продуктами домашнего приготовления, заготовленными впрок. Общепринятые в домашних условиях способы обработки пищевых продуктов, такие как консервирование в банках, копчение, маринование, соление, не приводят к уничтожению возбудителей ботулизма и их спор и при длительном хранении в этих продуктах может образоваться токсин.
Возбудители ботулизма широко распространены в природе, нормальные обитатели кишечника животных и человека, попадают в почву с фекалиями. Естественный резервуар-почва. Широкое распространение возбудителей ботулизма в почве ведет к попаданию этих микробов на овощи и фрукты, а также к обсеменению сырья, идущего для приготовления консервов, колбас и других продуктов.
Серологическая идентификация Cl.botulinum основана на выявлении экзотоксинов. В зависимости от антигенных свойств которых разделяют на 7 сероваров: А, В, С, D, E, F, G. Оптимальная температура для токсинообразования вариабельна: для бактерий типов А, В, С, D - 35°С, для типов Е и F - 28- 30°С. Патогенность Cl. botulinum для разных теплокровных различна. Заболевания у человека вызывают бактерии типов А, В, Е, F; бактерии типов С, D вызывают заболевания животных и птиц (в редких случаях от больных животных выделяют бактерии типов А и В). Патогенность типа G для человека и животных не доказана. Главные факторы патогенности Cl.botulinum - экзотоксины, оказывают нейротоксическое действие на организм, в организме возбудитель практически не размножается. Ботулинические токсины довольно устойчивы к температурным воздействиям. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10-15 минут и не разрушается в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Ботулинический токсин - самый сильный из всех биологических ядов.
Cl.botulinum типов А, В, С, D, E, F - очень близки по морфологии, культуральным свойствам и по действию их токсинов на организм человека и животных. Все они дают одинаковую клиническую картину болезни. Различные типы ботулинического микроба отличаются по антигенным свойствам вырабатываемых ими токсинов, токсин каждого типа нейтрализуется сывороткой того же типа.
По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки 0,6-1,0 х 3,0-9,0 мкм с закругленными концами. Палочки образуют субтерминальные или терминальные споры, палочки со спорой имеют вид теннисной ракетки, легко окрашиваются различными анилиновыми красками, молодые клетки грамположительны, при старении культуры (через 4-5 суток роста) палочки окрашиваются грамотрицательно, микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, капсул не образуют.
Возбудители ботулизма - строгие анаэробы, они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы, либо в герметически закрытых банках консервов. Возбудители ботулизма типа Е, а также непротеолитические штаммы типа В и некоторые штаммы типа F образуют на питательных средах и в пищевых продуктах кроме токсина и нетоксичный предшественник токсина - протоксин, который, не убивая мышей при парентеральном введении, проявляет свою биологическую активность при попадании в желудочно-кишечный тракт человека и животных в результате воздействия на него протеолитических ферментов.
При добавлении протеолитических ферментов (трипсина, панкреатина) in vitro также происходит активация протоксина, который переходит в токсин. Этот феномен следует учитывать при проведении лабораторной диагностики ботулизма.
Нередко консервные банки, куда вместе с продуктами попадает и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако, часто при наличии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят совершенно доброкачественными и консервные банки не дают «бомбажа». Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла.
Критерии диагностики. Лабораторная диагностика ботулизма преследует цель обнаружения и идентификации ботулинического токсина и выделение возбудителя. Лабораторному исследованию подлежат остатки пищевых продуктов, материал полученный от больного (кровь, испражнения, моча, промывные воды желудка, рвотные массы) и секционный материал. Кровь берут из вены пациента в количестве 5-10 мл, промывные воды желудка забирают в объеме 50-100 мл, кал 50-60 г. На секции забирают кусочки печени (50-60 г), отрезки кишечника и желудка и их содержимое. До поступления в лабораторию образцы хранят на холоде. Кровь исследуют только на наличие токсина (для чего проводят биологическую пробу), испражнения только на наличие возбудителя (проводят посев на питательные среды), весь остальной материал на наличие возбудителя и его токсина.
Морфология. Клостридии ботулизма -- крупные, полиморфные, с закругленными концами палочки; длина их 4--9 мкм, ширина 0,6--0,8 мкм. Образуют споры овальной формы, которые вместе с вегетативной клеткой напоминают теннисную ракетку. По Граму окрашиваются положительно, подвижные (перитрихи).
Культивирование. Возбудитель ботулизма -- строгий анаэроб. Лучше растет на нейтральной и слабощелочной среде. На среде Китта -- Тароцци вначале происходит помутнение бульона, затем, после оседания микробов на дно, наступает просветление. Клостридии ботулизма разжижают желатину, пептонизируют молоко. Культура ботулинуса во время роста приобретает запах прогорклого масла.
Токсинообразование. Клостридии ботулизма образуют токсин в кормах и продуктах. Он выдерживает кипячение в течение 10--15 мин. Пищеварительные ферменты (пепсин, трипсин) не разрушают токсины типов А, В, С, D, F и во много раз усиливают активность типа Е. Патогенность микроба обусловливается исключительно его токсинообразованием. Ботулинический токсин -- самый сильный из всех микробных ядов. Одного грамма токсина (по данным разных авторов) достаточно, чтобы уничтожить 20--60 млрд. мышей.
В таблице 2 показана токсичность ботулинического токсина в сравнении с другими ядами (данные А. В. Фомина, А. Ф. Коломиец, 1985).
Таблица 2
Токсичность ботулинического и некоторых других ядов для мыши
Вещество | Минимальная летальная доза, микромоль/кг | |
Ботулинический токсин | 3,3-10 -17 | |
Дифтерийный токсин | 4,2-10 -12 | |
Кураре | 7,2-10 -7 | |
Стрихнин | 1,5- 10 -4 |
Патогенность. К ботулиническому токсину чувствительны животные всех видов. У лошадей наступает паралич глотательной и дыхательной мускулатуры, смертность достигает 100%. У крупного рогатого скота клиника аналогична. У кур наблюдается расслабление шейной мускулатуры и парез ног. Из лабораторных животных к токсину чувствительны морские свинки, белые мыши. Через 3--4 дня после заболевания они погибают. К ботулинической токсикоинфекции чувствителен и человек.
Смертельная доза токсина для человека составляет около 1 мкг (10-6 г) Устойчивость. Благодаря образованию спор клостридии ботулизма устойчивы к неблагоприятным воздействиям среды. В высушенном состоянии сохраняют жизнеспособность десятилетиями. Хорошо переносят высокие температуры. К низким температурам также малочувствительны, сохраняют жизнеспособность при -- 190°С. Температуру -- 16°С выдерживают в течение года, но при оттаивании разрушаются и выделяют токсин.
Под действием 20%-ного формалина споры погибают через 24 ч, 10%-ного раствора соляной кислоты -- через час, этилового спирта -- через 2 мес.(С.244)
Микробиологический диагноз основан на обнаружении токсина в остатках корма (пищи) или в органах павшего животного. Фильтрат подозреваемого материала вводят подопытным животным и по их клинике определяют болезнь.
Иммунитет при ботулизме антитоксический. Человека лечат специфической противоботулинической сывороткой. Животным сыворотку вводят редко. Надежный метод профилактики болезни --иммунизация ботулиническнм анатоксином (Ассонов, 1989).
1.2.2 Clostridium perfringens
Clostridium perfringens - вид бактерий рода Clostridium - один из наиболее распространенных патогенных видов. По способности образовывать четыре главных токсина (?-, ?-, ?-, ?-) микроорганизмы разделяют на шесть сероваров: А, В, С, D, E и F. Cl. perfringens распространены повсеместно; бактерии выделяют из воды почвы, сточных вод. Они колонизируют кишечник животных и человека (выделяют у 25-35% здоровых лиц). Других природных резервуаров помимо пищеварительного тракта Cl. perfringens не имеют, почва и другие объекты внешней среды обсеменяются ими только фекальным путем. У человека Cl.perfringens вызывает два типа поражений - газовую гангрену и пищевые токсикоинфекции.
Вегетативные клетки Cl рerfringens представлены короткими крупными палочками с обрубленными под прямым углом концами (0,6-1,0х1х1,5 мкм). Отличительные особенности бактерий - строго положительная окраска по Граму и отсутствие подвижности. In vivo образуют капсулу. Бактерии хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, в старых культурах могут быть грамотрицательными. Споры крупные овальные расположены центрально или субтерминально. Термоустойчивость спор сероваров В и D относительно невысока, погибают при кипячении в течение 15-30 мин, споры типов А и С более устойчивы и выживают при кипячении в течение 1-6 часов. Cl.рerfringens типа А относительно толерантна к кратковременным кислородным воздействиям и способна расти в высоких столбиках сред, без герметизации вазелиновым маслом. На плотных средах бактерии образуют S-и R- колонии. S-колонии круглые, сочные, куполообразные, с гладкими ровными краями. Сначала они прозрачные, позднее становятся мутными серовато-белыми, R- колонии неправильной формы, бугристые с неровными шероховатыми краями; в глубине агара напоминают комочки ваты. На агаре с кровью обычно окружены зоной гемолиза. Характерное свойство колоний Cl.perfringens типа А, служащие дифференцирующим признаком, - способность менять серовато-белый цвет на зеленовато-оливковый после кратковременного пребывания в анаэробных условиях. На желточном агаре бактерии образуют колонии, окруженные зоной перламутрового преципитата, образующегося из лецитина куриного желтка под действием лецитиназы. Культуры Cl.рerfringens типа А имеют характерный запах масляной кислоты. Оптимум рН 7,2-7,4, но могут расти в интервале 5,0-8,5. На средах содержащих глюкозу рост происходит очень бурно, с образованием Н2 и СО2 и заканчивается через 8-12 часов. Первые признаки роста на среде Китт-Тароцци могут проявляться уже через 1-2 часа (особенно при 43°С) и проявляются помутнением и появлением пузырьков газа. Бактерии ферментируют углеводы с образование кислоты и газа. От прочих Cl.рerfringens отличает способность восстанавливать нитраты, расщеплять лактозу, образовывать лецитиназу. Протеолитическая активность слабая: расжижает желатину, не разлагает казеин, интенсивно створаживает молоко. Cl.рerfringens образует 12 токсинов (ферментов) и энтеротоксинов. Продуцентами энтеротоксина являются бактерии типов А и С, вызывающие пищевые токсикоинфекции.
Cl.perfringens, типов В, Д, Е вызывают тяжелые энтеротоксемии у мелкого и крупного скота, а также у птиц, можно предполагать их этиологическое значение при пищевых отравлениях у людей, в случае употребления в пищу мяса животных, обсемененных штаммами этих типов.
Cl.рerfringens типа А вызывает токсикоинфекции легкой и средней степени тяжести. Заболевание развивается остро, с болями в животе, рвотой и диареей (до 20 раз в сутки). Симптомы исчезают в последующие 12-24 ч, летальные исходы наблюдаются редко. Установлено, что при пищевых токсикоинфекциях, вызываемых Cl.perfringens типа А, основную роль в патогенезе заболевания играет энтеротоксин, вырабатываемый in vivo спорулирующими клетками этих микроорганизмов, которые попадают в желудочно-кишечный тракт при интенсивном обсеменении пищевых продуктов (105 и более в г/см3) указанными бактериями.
Cl.рerfringens типа С вызывает некротический энтерит. При острых формах болезнь может закончиться смертью пациента, в течение 18-24 ч. Симптомы аналогичны поражениям, вызываемым бактериями серовара А. Пищевые отравления чаще имеют место после употребления готовых мясных блюд, а также продуктов растительного происхождения, которые оказываются значительно обсемененными клетками Cl.perfringens типа А в результате нарушения правил приготовления и хранения пищи.
Критерии диагностики. При наличии клинических симптомов заболевания результаты бактериологического исследования подтверждают диагноз пищевого отравления, если получены следующие данные анализа: высокая обсемененность Cl.perfringens (более 105 в г/см3) пищевых продуктов или 106 в 1 г фекалий (ИНСТРУКЦИЯ 4.2.10-15-21-2006).
1.2.3 Возбудитель эмфизематозного карбункула
Эмфизематозный, или шумящий, карбункул (эмкар) вызывают Clostridium cnauvoel, это инфекционная остропротекающая неконтагиозная болезнь крупного рогатого скота в возрасте от 3 мес. до 4 лет. Иногда эмфизематозным карбункулом болеют овцы и козы. Болезнь характеризуется появлением в мышечной ткани газовых отеков, которые при надавливании крепитируют. Эмкар встречается почти во всех странах мира.
Морфология. Возбудитель имеет форму палочки с закругленными концами, ее длина 4--8 мкм, ширина 0,6--0,9 мкм (рис. 45). Клостридия Шово -- перитрих. Как в культуре, так и в патологическом материале образует споры, которые придают палочке форму веретена или лимона. Молодые культуры окрашиваются по Граму положительно, старые -- отрицательно.
Культивирование. Возбудитель эмфизематозного карбункула -- строгий анаэроб, растет при температуре 36-- 38°С. Культуру микроба выращивают на мясопептон-ном печеночном бульоне (МППБ). На среде Китта -- Тароцци вначале появляется муть, затем, после оседания спор на дно пробирки, наступает ее просветление. Под вазелиновым или парафиновым маслом образуются пузырьки газа. Культура приобретает запах прогорклого масла. На глюкозокровяном агаре колонии чаще образуют зону гемолиза и возвышение в центре, напоминающее перламутровую пуговицу. Разжижает желатину. Молоко свертывает медленно. Сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, галактозу, левулозу с образованием кислоты и газа.
Патогенность. Эмфизематозным карбункулом болеет рогатый скот. Возбудитель в организм попадает с кормом, чаще в летнее время, когда животные находятся на пастбище. Микроб из желудочно-кишечного тракта проникает в подкожную клетчатку и мышцы, где, размножаясь, образует углерода диоксид, водород и другие газы, что и обусловливает крепитацию.
Из лабораторных животных наиболее восприимчива морская свинка, она является хорошей биологической моделью' для воспроизведения болезни. Ее заражают патологическим материалом внутримышечно в области внутренней поверхности бедра. Смерть морской свинки наступает через 16--72 г. На месте инъекции мышцы темно-красного цвета, геморрагически инфильтрированы, иногда крепитируют (образование газа). Возбудитель образует токсины, которые могут вызвать гибель лабораторных и домашних животных.
Устойчивость. Споры микроба более устойчивы, чем вегетативные формы, при кипячении они сохраняются до 2 ч, при 110°С -- до 40 мин, в высушенном виде -- до 18 лет. Раствор сулемы (1:500) разрушает споры через 10 мин, 3%-ный раствор формалина -- через 15 мин.
Микробиологический диагноз ставят комплексно: на основании микроскопии, выращивания культуры возбудителя и биологической пробы. Для исследования направляют пораженные мышцы. Из них делают препараты, посевы на среду Китта -- Тароцци и готовят суспензию для заражения морской свинки. Выделение культуры возбудителя из материала от павшей морской свинки служит подтверждением правильности постановки диагноза.
Вакцинация. В настоящее время применяют концентрированную гидроокисьалюминиевую вакцину, которая была усовершенствована Ф. И. Коган и А. И. Колесовой в 1959 г. Крупному рогатому скоту и овцам вакцину вводят внутримышечно однократно в дозе 2 мл. Продолжительность иммунитета не менее 6 мес. Телятам, вакцинированным до 6-месячного возраста, вакцину вводят повторно. Против эмкара имеется сыворотка, но ее используют редко.
Лечение не всегда достигает своей цели, запаздывает, так как болезнь протекает остро. В отдельных случаях в общепринятых дозах применяют антибиотики: стрептомицин, дибиомицин, пенициллин.
1.2.4 Возбудитель столбняка
Столбняк вызывает Clostridium tetani, это раневая неконтагиоэная инфекция, известна со времен Гиппократа. Возбудитель болезни открыт в 1884 г. А. Николайераи, чистая культура получена в 1889 г. Ш. Китазато. Клиника болезни -- судороги, уплотнение мышц (жевательных, туловища), искривление шеи, хвоста -- следствие поражения нервной системы, образуемого микробом экзотоксином. Заражения животных и человека происходит при травмах и ранениях. Возбудитель в раны попадает из почвы, где и развивается. Токсин столбняка -- один из сильных микробных ядов.
Морфология. Возбудитель столбняка -- тонкая, подвижная (перитрих) палочка, длина ее 4--8 мкм, ширина -- 0,4--0,6 мкм. Образует округлые споры, которые располагаются на конце клетки, придавая ей вид барабанной палочки. Ранее такие бациллы называли плектридиями.
Культивирование. Бациллы столбняка -- строгие анаэробы. На среде Китта -- Тароцци возбудитель растет медленно, образует газ с неприятным запахом. После оседания микробных клеток на дно пробирки среда просветляется. На агаре столбиком или желатине растет, по уколу елочкой, причем верхушка не достигает поверхности среды. Оптимальная температура роста 35--37°С.
Устойчивость. Вегетативные формы возбудителя столбняка погибают при температуре 60--70°С в течение 30 мин. Споры выдерживают нагревание до 80°С в течение 6 ч, в кипящей воде сохраняются до 40--50 мин, в высушенном состоянии -- до 11 лет. При действии раствора сулемы (1:100) или 5%-ного раствора фенола споры погибают лишь через 10--12 ч.
Микробиологический диагноз на столбняк обычно не проводят, так как клиника болезни очень характерна. При необходимости из места ранения готовят мазки, делают посев на среду Китта -- Тароцци, а также заражают белую мышь. Симптомы столбняка у белой мыши развиваются на 2--3-й день.
Активная иммунизация против столбняка. Иммунитет у животных и человека против столбняка (его токсина) создается путем введения анатоксина. Его готовят из нативного столбнячного токсина, в который добавляют 0,3--0,5% формалина, алюмокалиевые квасцы, фенол и выдерживают при 37°С в течение 2--3 недель.
