Динамика изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках при воздействии предшественника лей-энкефалина и острого ЭБС была сходной с таковой в гипофизе и больших полушариях, однако, изменения были менее выражены (рис.8). Активность фермента в них также превышала показатели животных, подверженных воздействию острого ЭБС и интактных животных через 0,5 часа на 21% (p<0,05) и 15% (p<0,05), соответственно.
В гипоталамусе, гиппокампе и семенниках при введении пропептида стрессированным животным активность ФМСФ-ингибируемой КП превышала показатели обеих сравниваемых групп через 0,5 и 4 часа, 0,5 часа и 4, 24 и 72 часа, соответственно (рис.8).
Введение лей-энкефалин-арг перед началом стресса вызывало существенное по сравнению с стрессированными животными повышение активности в среднем мозге через 0,5 и 4 часа на 41% (p<0,01) и 24% (p<0,05), соответственно (рис.8). Активности фермента при этом практически не отличалась от интактных животных (рис.8).
Сходная тенденция наблюдалась в стриатуме, здесь активность ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа превышала соответствующие показатели группы животных, подвергавшихся воздействию острого ЭБС на 32%, p<0,05 и не отличалась от нормы во все исследуемые промежутки времени. Введение предшественника лей-энкефалина предотвращало обнаруженное при стрессе повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в стриатуме через 72 часа (рис.8).
Таким образом, практически во всех исследованных регионах мозга введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Активность фермента при этом была близка к норме.
Данные исследований показывают, что во всех исследованных отделах мозга и тканях активность ФМСФ-ингибируемой КП при совместном воздействии стресса и лей-энкефалин-арг (рис.8) была ниже соответствующих показателей активности фермента животных, которым инстиллировался предшественник пептида (рис.5).
3.5.3. Активность АПФ при введении лей-энкефалин-арг у крыс на фоне острого ЭБС.
Полученные данные об изменение активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг стрессированным животным представлены в таблице 7 (приложение) и на рис. 9.
Результаты исследования показывают, что при предварительном введение проэнкефалина статистически достоверные отличия от группы интактных животных обнаружены только в гипофизе. Показатели активности АПФ при этом выше таковых у интактных животных через 24 часа на 36%, p<0,05 (рис.9).
При сравнении изменений активности АПФ при совместном действии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС с соответствующими показателями стрессированных животных статистически достоверные отклонения обнаружены в гипофизе через 24 часа и в стриатуме через 4 часа (рис.9). Активность АПФ при предварительном введении лей-энкефалин-арг перед стрессом была выше показателей активности стрессированных животных на 36% (p<0,001) и 40% (p<0,05), соответственно. В другие исследованные промежутки времени статистически достоверных изменений не обнаружено.
В семенниках через 0,5 часа после введения лей-энкефалин-арг активность АПФ была ниже соответствующих показателей животных подверженных воздействию острого ЭБС на 20% (p<0,05). Однако, уже через 4 часа отмечено повышение активности АПФ по сравнению с группой стрессированных животных на 30% (p<0,01). В другие исследованные промежутки времени активность фермента сохранялась на достаточно высоком уровне и превышала показатели активности АПФ стрессированных животных через 24 часа на 23% (p<0,01) , а через 72 часа на 41% (p<0,01).
Таким образом если ЭБС в исследуемых отделах мозга практически не вызывал изменения активности АПФ, то введение лей-энкефалин-арг на фоне острого ЭБС вызывает некоторые изменения в активности АПФ в этих отделах, особенно ярко эта тенденция прослеживается в гипофизе через 24 часа, а также в стриатуме через 4 часа. Стойкая динамика увеличения активности АПФ показана также в семенниках.
Сравнение активности АПФ после введения лей-энк-арг стрессированным животным с введением этого пропептида интактным крысам показывает, что более выраженное влияние на активность фермента предшественник лей-энкефалина оказывает при введении его животным, не подвергающимся стресс-воздействию.
Таким образом, введение лей-энкефалин-арг перед началом острого ЭБС вызывает повышение активности КПН по сравнению с соответствующими показателями активности стрессированных и интактных животных в стриатуме - отделе мозга, связанном преиму-щественно с синтезом регуляторных пептидов стресспротективного действия. Предварительное введение предшественника лей-энкефалина предотвращало повышение активности КПН в гипофизе - отделе, где синтезируются стресс-пептиды.
Введение лей-энкефалин-арг перед острым ЭБС вызывало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 0,5 часа, по сравнению с соответствующими показателями стрессированных животных и предотвращало повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП через 72 часа. Особенно ярко такая тенденция прослеживается в тех отделах мозга и тканях, где осуществляется синтез биологически активных пептидов, проявляющих выраженную антистрессорную активность. Активность ФМСФ-ингибируемой КП при этом была близка к норме.
Аргинизированный лей-энкефалин влиял на активность АПФ головного мозга, надпочечников и семенников стрессированных животных в гораздо меньшей степени, чем на активность КПН и ФМСФ-ингибируемой КП. Наибольшее влияние пептида обнаружено в семенниках.
Обнаружено, что введение лей-энкефалин-арг интактным и стрессированным животным вызывает различные по степени выражен-ности и направленности изменения активности изучаемых ферментов. Наиболее значительные изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ обнаружены у животных, не подвергавшихся воздействию стресса.
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.
В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем биохимии, физиологии и медицины является изучение молекулярных механизмов возникновения и развития стресса. Особую значимость при этом приобретает изучение острого стресс-воздействия на организм, поскольку именно кратковременное импульсное стрессирование приводит к экстренному повышению адаптивных способностей. Менее всего изучено влияние острого эмоционально-болевого стресса (ЭБС). Важную роль в устранении и/или ограничении стрессорных нарушений играет система эндогенных опиоидов [8, 14, 102, 106, 135, 236, 242]. Синтез природных опиоидных пептидов и их синтетических аналогов открыл перспективы для их использования при разного рода стресс-повреждениях организма [123]. Было показано, что выраженным антистрессорным действием обладают лей- и мет-энкефалины, лей-энкефалин-арг, синтетический аналог лей-энкефалина - даларгин [69, 105]. Несмотря на короткую продолжительность жизни экзогенных опиоидных пептидов в организме, проявляемые ими эффекты сохраняются на протяжении достаточно длительных промежутков времени [10, 11, 13, 119]. Одним из малоизученных вопросов в понимании механизмов длительного последействия экзогенных опиоидных пептидов является выяснение путей образования и инактивации других регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на введение опиоидов. Поскольку известно, что уровень большинства биологически активных пептидов и, следовательно, степень реализации адаптационных реакций при стресс-повреждениях организма, в значительной степени определяется активностью пептидгидролаз, то особый интерес вызывает изучение механизмов регуляции активности ферментов обмена нейропептидов при стресс-воздействии.
Исходя из вышеизложенного, интересным представляется изучение влияния экзогенного предшественника лей-энкефалина - лей5-энкефалин-арг6 на активность некоторых ферментов обмена нейропептидов - КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ в норме и при воздействии острого ЭБС.
Поскольку КПН и АПФ участвуют в формировании стрессовой реакции организма, а дополнительное экзогенное введение жидкости влечет за собой возникновение стресса, то введение пропептида осуществлялось способом, который согласно данным [1, 24, 119] менее всего травмирует животное, обеспечивает более полное проникновение экзогенного вещества в мозг и позволяет использовать меньшие концентрации веществ - инстилляцией на конъюнктиву глаза.
Существенную роль в проявлении специфической активности изучаемых ферментов по отношению к регуляторным пептидам играют особенности их тканевой локализации. В связи с этим, представляется необходимым более детальное изучение регионального и тканевого распределения активности КПН, ФМСФ - ингибируемой КП и АПФ.
Максимальная активность КПН у интактных животных показана в гипофизе - отделе, где синтезируются стресс-пептиды и многие нейропептиды стресс-протективного действия (табл.1). Высокий уровень активности фермента обнаружен также в гипоталамусе, четверохолмии, стриатуме - отделах лимбической системы, богатых опиоидными и другими нейропептидами [156, 168, 169, 221, 247]. Надпочечники и семенники характеризуются низкими показателями активности КПН. Полученные данные о региональном и тканевом распределении активности КПН, хорошо согласуются с литературными [37, 187, 248]. Таким образом, полученные нами сведения о высоком уровне активности этого фермента в отделах мозга и тканях, связанных с образованием и секрецией многих регуляторных пептидов [235] подтверждают участие КПН в процессинге нейропептидов в этих регионах.
Биологическая роль ФМСФ-ингибируемой КП в организме к настоящему моменту остается неясной. Сведения о тканевом и региональном распределении ФМСФ-ингибируемой КП носят фрагментарный характер. У исследованных нами групп животных высокая активность ФМСФ-ингибируемой КП обнаружена в надпочечниках и гипофизе (табл.1). Регионы мозга характеризуются более низкими показателями, при этом активность ФМСФ-ингибируемой КП распределена достаточно равномерно. Полученные нами данные о распределении активности ФМСФ-ингибируемой КП согласуются с уровнем нейропептидов в этих структурах, что подтверждает ранее выдвигаемые предположения [49, 53, 119, 149]о вовлечении этого фермента в обмен регуляторных пептидов. Однако более конкретное определение роли этого фермента в обменных процессах остается на данном этапе открытым вопросом. В связи с вышесказанным, представляется необходимым более детальное изучение некоторых характеристик этого фермента: сравнение уровня его активности с активностью КПН - фермента, биологическая роль которого определена, а также исследование распределения активности ФМСФ-ингибируемой КП в отделах мозга и органах при различных функциональных и патологических состояниях организма.
Интересно отметить, что в гипофизе - отделе, в котором синтези-руются многие нейропептиды и гормоны пептидной природы [232], активность КПН существенно не отличается от таковой для ФМСФ-ингибируемой КП, в то время как в надпочечниках - отделе, где синтезируются преимущественно энкефалины [33, 34], активность ФМСФ-ингибируемой КП существенно выше активности КПН. Как показывают данные некоторых исследований, пептидные гормоны, синтезирующиеся в гипофизе, содержат в неактивной форме перед остатком основной аминокислоты остатки аминокислот - аланина и глицина [62]. Образующиеся в надпочечниках энкефалины содержат в качестве предпоследних остатки гидрофобных аминокислот (лейцина и метионина) [62]. Принимая во внимание, также, особенности регионального распределения КПН и ФМСФ-ингибируемой КП можно высказать предположение об участии этих ферментов в процессинге предшественников нейропептидов, различных по своему качественному составу. Возможно, что ФМСФ-ингибируемая КП участвует в процессинге проформ, содержащих в качестве предшествующей основным аминокислотам - аргинину и лизину, гидрофобной аминокислоты. Что же касается КПН, то она, вероятно, участвует в процессах модификации проформы с предшествующей аминокислотой, содержащей короткий алифатический радикал (аланин и глицин).
Достаточно высокий уровень активности ФМСФ-ингибируемой КП, по сравнению с КПН, обнаружен в семенниках. Поскольку известно, что семенники, наряду с образованием некоторых регуляторных пептидов, характеризуются и достаточно высоким уровнем катаболизма белков, а свойства ФМСФ-ингибируемой КП во многом схожи с таковыми у лизосомальной КПА (Кф 3.4.16.1), которая вовлекается в интенсивный катаболизм белка, то показанная высокая активность ФМСФ-ингиби-руемой КП может являться свидетельством вовлечения ее в процессы инактивации регуляторных пептидов в периферических тканях. В связи с этим, можно выдвинуть предположение о существовании различных форм фермента, по-разному проявляющих свою активность в мозге и периферических тканях.
Распределение активности АПФ хорошо изучено во внемозговых образованиях, что же касается исследования активности этого фермента в различных регионах мозга, то данному вопросу, до недавнего времени уделялось недостаточное внимание. Известно, что АПФ участвует в процессинге ангиотензина , инактивации брадикинина, в последова-тельном гидролизе энкефалиновой молекулы [66, 180, 182, 196, 209, 234].
Изучение активности АПФ у интактной группы животных показало, что наибольшая активность фермента обнаруживается в гипофизе и семенниках (табл.1), где синтезируются многие биологически активные пептиды. Достаточно высокие показатели активности отмечены, также, в стриатуме - отделе, характеризующимся высоким содержанием нейропептидов [62, 221]. Данные ряда исследований свидетельствуют о том, что закономерности, описывающие роль периферической ренин-ангиотензиновой системы не могут быть перенесены на системы центральной регуляции, ввиду существования определенной автономии и биохимической специфичности АПФ в мозге и на периферии [66, 196, 222]. В связи с этим, присутствие высокой активности АПФ как в отделах мозга, так и в семенниках может быть признано как свидетельство участия этого фермента в обмене различных по своему функциональному составу нейропептидов, содержащихся в мозге и периферических тканях. Не исключена также возможность участия АПФ в обмене нейропептидов, одинаковых по своему функциональному составу, хотя этот процесс, вероятно, по-разному протекает в мозге и тканях, что может свидетельствовать в пользу существования изофермента [66].
Таким образом, полученные нами сведения о региональном и органном распределении АПФ хорошо согласуются с литературными данными по локализации нейропептидов в структурах мозга и тканях [156, 196, 221], что подтверждает участие АПФ в обмене регуляторных пептидов [182, 183].
Основой для более детального представления о биологической роли изучаемых ферментов в мозге и периферических тканях могут послужить исследования по изучению их активности при экстремальных воздействиях.
Известно, что при воздействии стресс-факторов осуществляется мобилизация важнейших физиологических систем организма, направленная на поддержание его гомеостаза и адаптации к неблагоприятным условиям среды [144]. Развитие адаптационных реакций является следствием активации стресс-лимитирующих систем, таких как ГАМК-эргическая, серотонинэргическая, энкефалинэргическая [5, 116], что в первую очередь выражается в усилении синтеза их основных компонентов. Известно, что одним из видов воздействия, приводящим к генерализованной мобилизации стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем организма является острый ЭБС [37, 70, 121, 141, 145, 155]. Однако многие аспекты возникновения и развития стресс-реакции при воздействии ЭБС изучены недостаточно. Менее всего исследованы ферментативные механизмы, обеспечивающие функцио-нирование физиологических систем при остром ЭБС.
Изучение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у крыс при воздействии острого ЭБС показало изменение их активности в изучаемых отделах мозга и периферических тканях (табл. 2, рис.1-3).
Наиболее выраженное повышение активности КПН при остром ЭБС отмечено в гипофизе. Активность фермента была выше показателей интактных животных (табл.2, рис.1), что согласуется с изменениями его активности при других видах стресса [42, 64]. Повышение активности КПН в ранний период после стресса в гипофизе - отделе, где синтези-руются стресс-пептиды [142, 232, 243], по-видимому, связано с увеличением их синтеза и секреции. Поскольку известно, что КПН in vivo вовлекается в образование АКТГ [189], являющегося важным компонентом стресс-реализующих систем, то повышение активности КПН через 0,5 и 4 часа после воздействия является специфичным ответом организма на стресс и способствует увеличению размаха стресс-реакции в организме. Достаточно длительное повышение активности КПН отражает длительный характер ответной реакции организма на воздействие стресс-фактора. Известно, что после однократного ЭБС вслед за катаболической стадией, развивается более длительная - анаболическая, которая характе-ризуется генерализованной активацией синтеза различных физиологически активных веществ, способствующих адаптации организма к стрессовой ситуации [121, 122]. Поскольку гипофиз обладает повышенным содержанием энкефалинов [221], вещества Р [241], то, вероятно, повышение в нем активности КПН через 24 и 72 часа связано с участием фермента в процессинге этих регуляторных пептидов. Необходимость в дополнительном синтезе пептидов стресс-протективного действия обусловлена интенсивной секрецией их в начальном периоде развития стресс-реакции и, следовательно, истощением их запаса. Таким образом, полученные результаты согласуются с литературными данными об участии КПН не только в развитии стресса, но и в ограничении интенсивности стресс-реакции [37, 142, 232, 243].
Установлено, что при воздействии стресса в мозге увеличивается содержание опиоидов, вещества Р, и др. [35, 138, 139, 236]. Обнаруженное на поздней стадии развития стресса повышение активности КПН в стриатуме и больших полушариях свидетельствует о вовлечении фермента в процессинг этих биологически активных пептидов, что приводит к увеличению их содержания в названных структурах мозга при остром ЭБС и способствует угасанию стресс-реакции.
Содержание стресс-протективных пептидов - энкефалинов, вещества Р - в среднем мозге и гиппокампе при стрессе также увеличивается [56]. Однако в этих структурах мозга через 4 часа после воздействия активность фермента была ниже показателей интактной группы. Сходная тенденция к снижению активности КПН отмечена и в надпочечниках. Известно, что КПН локализована преимущественно в везикулах секреторных клеток [195]. В результате их опустошения после воздействия стресса высвобождаются как пептиды, так и локализованные в них молекулы КПН. Следовательно, обнаруженное снижение активности КПН может быть обусловлено уменьшением числа активных молекул фермента в секреторных везикулах.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
