В отличие от КПН, выраженное повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП во всех отделах мозга и надпочечниках наблюдалось через 72 часа после воздействия (табл.2, рис.2). Наиболее существенные изменения отмечены в больших полушариях и надпочечниках.
Известно, что при остром ЭБС обнаруживается значительное увеличение активности лизосомальных ферментов, которые вовлекаются в деградацию избытка нейропептидов, синтезированных в ответ на стресс [121]. При этом отмечено, что активность лизосомальных ферментов остается повышенной даже через 5 суток после завершения стресс-воздействия [121]. Поскольку ФМСФ-ингибируемая КП, предположительно, является изоферментом лизосомальной КПА [53], то увеличение активности фермента через 72 часа после острого ЭБС может являться свидетельством участия ФМСФ-ингибируемой КП в деградации избытка регуляторных пептидов, синтезируемых в ответ на стресс. Повышение активности ФМСФ-ингибируемой КП в надпочечниках - органе, содержание энкефалинов в котором при воздействии стресса увеличивается [34] и больших полушариях, характеризующихся высоким уровнем катаболизма [17, 22], подтверждает выдвинутое предположение.
В отличие от ФМСФ-ингибируемой КП, активность которой существенно повышалась в надпочечниках, наиболее выраженные изменения активности КПН наблюдались в гипофизе. Поскольку известно, что в надпочечниках синтезируются преимущественно энкефалины, а в гипофизе - гормоны пептидной природы, то полученные данные могут свидетельствовать об участии этих ферментов в обмене разных биологически активных пептидов.
Сходная с КПН тенденция к повышению активности ФМСФ-ингибируемой КП в ранние периоды после стресса отмечена в семенниках, где активность фермента была выше нормы только через 0,5 часа. Не исключено, что в семенниках данный фермент может вовлекаться и в процессинг регуляторных пептидов при стрессе.
Таким образом, в ответ на воздействие острого ЭБС вовлекается как КПН, так и ФМСФ-ингибируемая КП. Различная динамика изменений активности этих ферментов в мозге и периферических тканях позволяет выдвинуть предположение о включении этих ферментов на разных этапах обмена нейропептидов. При этом, обе КП участвуют в обмене регуляторных пептидов в тех отделах мозга и органах, которые предохраняют стресс-систему организма от истощения.
Одним из важных звеньев в механизмах функционального взаимодейтсвия энкефалинэргической, ренин-ангиотензиновой и гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС) является АПФ [209]. В связи с этим, исследование активности АПФ после воздействия острого ЭБС рассматривается как значимое звено в цепи изучаемых реакций организма, так как изменения в активности АПФ в отделах мозга и периферических тканях могут отражать региональную функцию ангиотензин-образующей системы в условиях стресса.
Полученные нами данные показали снижение активности АПФ в стриатуме и гипофизе через 4 часа после воздействия ЭБС (табл.2, рис.3). При воздействии стресса наблюдается нарушение проницаемости мембран и повышение содержания ионов Na+, что может вызвать торможение синтеза АПФ [64], чем, вероятно, и объясняется наблюдаемое снижение активности АПФ.
До настоящего времени функциональная роль АПФ в половых органах млекопитающих остается не до конца изученной. Известно, что функции семенников модулируются опиоидными пептидами [197], образование которых при воздействии острого ЭБС увеличивается. Структура энкефалинов такова, что АПФ может расщеплять их до ди- и три-пептидов [180]. В связи с этим, повышение активности АПФ в семенниках через 0,5 часа после острого ЭБС может быть охарактеризовано как ответная реакция организма на повышение уровня опиоидных пептидов, что направлено на стабилизацию вызванного стрессом повышенного баланса опиоидных пептидов. Возможно, что снижение активности АПФ в семенниках в последующие промежутки времени является следствием замедления процесса инактивации синтезированных в ответ на стресс-воздействие нейропептидов.
Таким образом, обнаруженные при воздействии острого ЭБС изменения активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ являются, вероятно, следствием их участия в процессах синтеза и/или деградации компонентов стресс-лимитирующих и стресс-реализующих систем.
Наблюдаемое после стресс-воздействия увеличение синтеза и секреции многих биологически активных пептидов, приводит не только к развитию адаптационных реакций, но и к истощению нейрогуморальных систем [4, 145]. Интенсивное исследование системы эндогенных опиоидных пептидов показало их участие в механизмах физиолого-биохимической регуляции процессов, возникающих при стресс-повреждении организма [100, 101, 102, 125, 134]. Особое практическое значение, в связи с этим, имеет использование опиоидных пептидов и их синтетических аналогов в качестве агентов, компенсирующих изменения в метаболизме мозга и органов животных при стрессе. Повышенное стресс-протективное свойство аргининсодержащего гексапептидного аналога лей-энкефалина - даларгина объясняется, прежде всего, наличием в его молекуле концевого аргининового компонента [105, 146]. В связи с этим, не исключено, что в регуляцию метаболических процессов в мозге и органах может вовлекаться и аргинизированный предшественник лей-энкефалина (лей5-энкефалин-арг6). Установлено, что при периферическом введении повышенной проницаемостью ГЭБ, а, следовательно, и более выраженным воздействием на функциональные системы, характеризуются не сами биологически активные вещества, а их ближайшие предшественники [82]. Это обусловило использование в наших исследованиях лей5-энкефалин-арг6. Поскольку известно, что модулирующее действие экзогенных веществ зависит от исходного состояния физиологических систем и может по-разному проявляется при оптимальном и различных функциональных состояниях организма [107], то представляется необходимым исследование влияния лей5-энкефалин-арг6 на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ у интактных животных.
Введение предшественника лей-энкефалина в дозе 20 мкг/кг массы крысы вызывало существенное повышение активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ во всех исследованных отделах мозга и тканях по сравнению с контролем (табл.3, рис.4-6). Полученные данные свидетельствуют о вовлечении изучаемых ферментов в ответ организма на введение лей5-энкефалин-арг6.
Максимальное изменение активности ферментов в отделах мозга и периферических тканях обнаружено через 0,5 часа после инстилляции. Наиболее выраженное повышение активности КПН показано в гипофизе, ФМСФ-ингибируемой КП - в надпочечниках, АПФ - в семенниках.
Полученные нами данные (рис.4-6) указывают на наличие достаточно длительного влияния лей-энкефалин-арг на активность данных ферментов, что согласуется с уже проведенными исследованиями [59, 107, 113, 119] о пролонгированном действии многих регуляторных пептидов. Одним из механизмов, способствующих проявлению такого рода длительных эффектов является их связывание с белками-переносчиками [78], которые способны защищать пептид от достаточно быстрого действия протеаз. Постепенная диссоциация образующегося комплекса “пептид-носитель” приводит к поддержанию концентрации пептида на уровне, необходимом для реализации физиологических эффектов в течение достаточно длительных промежутков времени. Проявление длительных эффектов экзогенно вводимых веществ объясняют, также, на основе теории о функциональной непрерывности [59, 113]. Существенной особенностью которой является способность каждого регуляторного пептида индуцировать или ингибировать образование или деградацию других пептидов. Вследствие развивающихся при этом каскадов биохимических реакций, эффект экзогенного пептида будет проявляться и тогда, когда исходное вещество уже полностью разрушено. Однако эти сведения представлены только для активных пептидов. В нашей же работе пролонгированное действие наблюдалось и при введении предшественника лей-энкефалина - лей-энкефалин-арг. Не исключено что изучаемые ферменты - КПН, ФМСФ-ингибируемая КП и АПФ участвуют в биогенезе биологически активных пептидов, синтезируемых в ответ на введение лей-энкефалин-арг, выступающего в роли индуктора.
Длительное повышение активности КПН после введения лей-энкефалин-арг отмечено в гипофизе, стриатуме и гипоталамусе (табл.3, рис.4), где осуществляется синтез многих регуляторных пептидов [156, 221]. Наиболее существенное повышение активности КПН обнаружено в гипофизе. Вероятно, что экзогенно введенный лей-энкефалин-арг инициировал ряд последовательных реакций синтеза других регуляторных пептидов, в процессинге которых участвует КПН, что и вызывало длительное повышение активности изучаемого фермента.
Значительное увеличение активности ФМСФ-ингибируемой КП наблюдалось в надпочечниках, гипофизе, гипоталамусе и среднем мозге (табл.3), характеризующихся высоким содержанием нейропептидов. Следовательно, можно выдвинуть предположение о вовлечении исследуемого фермента в процессинг регуляторных пептидов в этих регионах при введении лей-энкефалин-арг. Не исключено, что возрастание активности фермента в первые 0,5 часа после начала эксперимента может быть связано с вовлечением его в процессы преобразования в активную форму введенного пропептида (индуктора). Дальнейшее же увеличение активности, вероятно, является следствием участия ФМСФ-ингибируемой КП в процессинге регуляторных пептидов, которые образуются в ответ на введение индуктора в исследованных регионах мозга и надпочечниках.
Известно, что АПФ участвует как в процессинге, так и в инактивации нейропептидов, проявляя при этом дипептидилкарбоксипептидазную и эндопептидазную активности [182, 183, 209, 223, 241]. Поскольку предполагается, что экзогенный лей-энкефалин-арг инициирует процессы образования активных форм некоторых нейропептидов, то, не исключено, что АПФ может играть роль регулирующего фактора в этих реакциях, контролируя уровень введенного пропептида. Достаточно высокая активность АПФ после введения предшественника лей-энкефалина обнаружена в гипофизе и стриатуме (рис.6). Причем, следует подчеркнуть, что статистически достоверное повышение активности в этих отделах зарегистрировано только через 0,5 часа (рис.2). Возможно, что столь кратковременное повышение активности АПФ в исследуемых регионах мозга связано с его участием в инактивации введенного проэнкефалина или в деструкции избытка синтезируемых регуляторных пептидов. Существенное и длительное повышение активности АПФ при введении лей-энкефалин-арг отмечено в семенниках. Вероятно, что АПФ участвует в процессинге ряда биологически активных веществ, синтезируемых в этом органе в ответ на введение лей-энкефалин-арг. Известно также, что в семенниках высок уровень процессов катаболизма. Следовательно, не исключена возможность участия АПФ и в процессах инактивации избытка синтезируемых нейропептидов.
Таким образом, обнаруженное после введения лей-энкефалин-арг повышение активности исследуемых ферментов в тех отделах мозга и тканях, где синтезируется большое количество нейропептидов, является свидетельством изменения метаболической активности головного мозга и периферических тканей. Вероятно, что КПН, ФМСФ-ингибируемая КП и АПФ участвуют в процессах синтеза и/или инактивации ряда биологически активных пептидов, синтезируемых в ответ на введение лей5-энкефалин-арг6. В связи с этим, не исключено, что цепные реакции образования или деградации регуляторных пептидов в ответ на введение индуктора “запускаются” посредством изменения активности данных пептидгидролаз.
Следовательно, представляется интересным вопрос о механизме регуляции активности КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ под влиянием лей-энкефалин-арг. Обнаружено, что in vitro активность КПН и АПФ ингибируется пропептидом, что согласуется с литературными данными [160, 207]. На активность ФМСФ-ингибируемой КП предшественник лей-энкефалина не оказывал влияния (табл.4).
Показанный эффект ингибирования активности КПН может быть обусловлен конкуренцией двух субстратов (дансил-фен-ала-арг - субстрат для определения активности фермента и экзогенно введенный лей-энкефалин-арг) за связывание с ферментом [38]. Однако известно, что КПН локализована в секреторных везикулах, проникновение в которые экзогенного пропептида представляется маловероятным [187, 195]. Известно также, что энкефалины влияют на уровень экспрессии мРНК ряда нейропептидов [231, 246]. Уровень мРНК КПН и многих нейропептидов координированно регулируется секретогенами. Поэтому представляется более вероятным, что экзогенно введенный лей-энкефалин-арг, влияет на уровень экспрессии мРНК КПН, что приводит к изменению активности фермента. Активация АПФ, вероятно, объясняется действием экзогенного лей-энкефалин-арг на активность эндогенных ингибиторов АПФ [73, 85]. Таким образом, показанное несоответствие во влиянии лей-энкефалин-арг на активность КПН, ФМСФ-ингибируемой КП и АПФ in vivo и in vitro свидетельствует о существовании in vivo механизмов, опосредующих действие экзогенного предшественника лей-энкефалина.
Известно, что экзогенное введение опиоидных пептидов способствует стимуляции образования и выброса эндогенных опиоидов, что является одним из факторов естественной профилактики истощения стресс-лимитирующих систем и направлено на адаптацию организма к стрессу [69, 116, 198]. Выдвинутое ранее предположение о инициации процессов синтеза и деградации некоторых биологически активных пептидов при введении лей-энкефалин-арг, послужило основанием для использования этого вещества в качестве агента, повышающего активность эндогенной энкефалинэргической системы.
При введении лей-энкефалин-арг непосредственно перед моделированием острого ЭБС активность всех изучаемых протео-литических ферментов изменялась по сравнению с соответствующими показателями у животных, подверженных стрессу, введению пропептида и интактных животных.
При совместном влиянии острого ЭБС и лей-энкефалин-арг активность КПН во всех исследуемых отделах мозга и периферических тканях крыс достоверно отличалась от соответствующих показателей стрессированных животных (табл.5, рис.7). Полученные данные свидетельствуют о вовлечении КПН в реализацию биохимических процессов, индуцированных введением пропептида. Наиболее существенное повышение активности фермента отмечено в отделах мозга, характеризующихся высоким содержанием стресс-протективных веществ. Не исключено, что предшественник лей-энкефалина, предварительно введенный в организм животного, способствовал “запуску” каскада биохимических реакций синтеза веществ, участвующих в адаптации организма к стресс-факторам [116, 132, 241, 242].
Согласно полученным данным, введение лей-энкефалин-арг перед началом стресс-воздействия предотвращало повышение активности КПН в гипофизе (табл.5, рис.7), отмеченное при остром ЭБС. Известно, что при любой форме стресса общим и наиболее существенным моментом является активация ГГНС, характеризующаяся избыточным образованием и секрецией гормонов стресса [21, 128, 134, 143, 144, 150]. Показано также, что введение энкефалинов блокирует активность ГГНС [74, 124, 134], приостанавливая процессы синтеза гормонов пептидной природы, в частности АКТГ. Поскольку, КПН участвует в биосинтезе АКТГ в гипофизе, то показанное после введения лей-энкефалин-арг снижение активности КПН по сравнению с группой стрессированных животных позволяет выдвинуть предположение о способности лей-энкефалин-арг проявлять эффекты сходные с таковыми активных форм энкефалинов. Ранее мы предположили, что повышение активности карбоксипептидазы Н в гипофизе на поздних этапах исследования (24 и 72 часа) после воздействия острого ЭБС показывает ее участие в активизирующихся при стрессе процессах синтеза стресс-протективных пептидов. Полученные в данной серии эксперимента результаты об увеличении активности КПН через 24 и 72 часа в гипофизе по сравнению с интактной группой, могут являться свидетельством того, что при введении пропептида стрессированным животным фермент также включается в процессы синтеза пептидов, способствующих адаптации организма к стресс-воздействию.
Таким образом, снижение активности КПН в гипофизе при совместном действии лей-энкефалин-арг и стресса через 0,5 и 4 часа может способствовать уменьшению выработки и секреции стресс-пептидов, а повышение активности через 24 и 72 часа - активизации процессов синтеза стресс-протективных веществ и, следовательно, адаптации к стрессу.
Существенное повышение активности КПН отмечено в стриатуме - отделе, где синтезируются нейропептиды, обладающие выраженным антистрессорным действием [221] (табл.5, рис.7). В ранние промежутки времени (0,5 и 4 часа) активность КПН была выше по сравнению с активностью у стрессированных и интактных животных. Напротив, при воздействии острого ЭБС активность фермента в стриатуме повышалась (табл.2, рис.1) на более поздних этапах исследования (через 24 и 72 часа). Известно, что предварительное введение компонентов стресс-лимитирующих систем вызывает ограничение катаболической и удлинение анаболической стадии, которая характеризуется активацией синтеза веществ, играющих важную роль в развитии адаптационных реакций [121]. На основании полученных нами данных о повышении активности КПН в стриатуме на ранних стадиях после совместного воздействия двух факторов, можно предположить, что при инстилляции предшественника лей-энкефалина при ЭБС происходит активация синтеза многих стресс-протективных веществ (вещество Р, энкефалины и др), что способствует уменьшению размаха стресс-реакции.
Обнаруженное увеличение активности исследуемого фермента через 4 часа после введения лей-энкефалин-арг на фоне стресса (относительно группы стрессированных животных, не получавших пропептид) в гиппокампе, больших полушариях, гипоталамусе и надпочечниках - характеризующимися высоким содержанием нейропептидов [156] (табл.5, рис.7) свидетельствует, вероятно, о включении КПН в процессинг регуляторных пептидов в этих структурах.
Таким образом, предварительное введение стрессированным животным предшественника лей-энкефалина вызывает изменения активности КПН в регионах мозга и периферических тканях, способствующие адаптации к стрессу. Поскольку проникновение экзогенного пропептида в секреторные везикулы, где локализован фермент [38, 189] представляется маловероятным, следовательно, лей-энкефалин-арг при стрессе опосредовано влияет на активность КПН, вероятно, через изменение уровня экспресии гена фермента.
При совместном воздействии лей-энкефалин-арг и острого ЭБС обнаружены разнонаправленные изменения активности ФМСФ-ингибируемой КП в отделах головного мозга и периферических тканях крыс.
Предварительное введение лей-энкефалин-арг стрессированным животным предотвращает повышение активности фермента через 72 часа, отмеченное при воздействии острого ЭБС. В более ранние промежутки времени активность ФМСФ-ингибируемой КП была выше (табл.6, рис.8). Наиболее выраженные изменения обнаружены в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе и надпочечниках (рис.8) - структурах, богатых нейропептидами, синтез которых, по нашему предположению, усиливается под воздействием введенного пропептида.
Известно, что при совместном действии опиоидных пептидов и стресса обмен веществ, по прошествии более одного часа после воздействия, ускоряется, однако смещения его в сторону катаболизма, как это отмечается при стрессе, не происходит [18, 22, 121, 138]. ФМСФ-ингибируемая КП, предположительно, является изоферментом лизосомальной КПА, участвующей в деградации биологически активных веществ [49, 53, 233]. Следовательно, отмеченное через 72 часа после введения лей-энкефалин-арг стрессированным животным снижение активности фермента в гипофизе, среднем мозге, гипоталамусе, больших полушариях по сравнению с показателями стрессированных животных свидетельствует о снижении уровня катаболических процессов в исследуемых отделах. Активность фермента при этом практически не отличается от соответствующих показателей нормы (рис.8).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12
