Уксус - это продукт, содержащий не менее 4% (вес/объем) уксусной кислоты; его получают с помощью двухстадийного процесса. Вначале осуществляют спиртовое брожение, в ходе которого сахар сырья превращается в спирт при участии S. cerevisiae. После завершения этого этапа дрожжам дают осесть и собирают надосадочную жидкость. Содержание спирта доводят до 10-13%. На следующем этапе этиловый спирт превращается в уксусную кислоту (промежуточным продуктом является ацетальдегид). Все процессы получения уксуса идут при участии смешанных культур Acetobacter. Брожение происходит а аэробных условиях с потреблением больших количеств кислорода и выделением тепла.
Производство кормового белка
В соответствии с нормами питания человек должен ежедневно получать с пищей 60-120 г. полноценного белка. Если растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все белковые аминокислоты из углекислоты, воды, аммиака и минеральных солей, то человек и животные не могут синтезировать некоторые аминокислоты (валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и фенилаланин), которые называют незаменимыми. Эти аминокислоты должны поступать в организм в готовом виде с пищей; их отсутствие вызывает тяжелые заболевания человека и снижение продуктивности сельскохозяйственных животных. Незаменимые аминокислоты наиболее сбалансированы в белках семян сои. Относительно высокую биологическую ценность имеют также белки зерна риса и гороха. В белках зерна пшеницы и ячменя очень мало лизина, метионина и изолейцина, а в белках кукурузы ещё и триптофана.
Особый интерес представляет использование микроорганизмов в качестве источника белка и витаминов при производстве пищевых продуктов. Перспектива и экономическая целесообразность употребления микроорганизмов в технологии производства пищевых продуктов диктуется рядом факторов:
1) возможностью использования самых разнообразных химических соединений, в том числе отходов производства, для культивирования микроорганизмов;
2) высокой интенсивностью синтеза белков;
3) относительно несложной технологией культивирования микроорганизмов;
4) относительно высоким содержанием белка и витаминов;
5) повышенным содержанием незаменимых аминокислот по сравнению с растительными белками;
6) возможностью направленного генетического влияния на химический состав микроорганизмов в целях совершенствования белковой и витаминной ценности продукта (ГМО).
В настоящее время мировой дефицит белка составляет около 15 млн. т. Наиболее перспективен микробиологический синтез, что следует из представленных ниже данных. Если для крупного рогатого скота требуется 5 лет для удвоения белковой массы, для свиней - 4 мес., для цыплят - 1 мес., то для бактерий и дрожжей - 1-6 ч. Мировое производство пищевых белковых продуктов за счет микробного синтеза составляет более 15 тыс. т в год. В качестве источников кормового белка чаще используют различные виды дрожжей и бактерий, микроскопические грибы, одноклеточные водоросли, белковые коагулянты травянистых растений.
Дрожжевые клетки в качестве источника углерода для роста способны использовать неразветвленные углеводороды с числом от 10 до 30 углеродных атомов в молекуле. В основном они представлены жидкими фракциями углеводородов нефти с температурой кипения 200-320?С. В России первый завод по производству кормовых дрожжей из жидких парафинов нефти вступил в действие в 1971 г. Альтернативная цепочка расщепления углеводородов: н-Алканы (С9 - С30) Алифатические спирты
Алифатические кислоты Ацил-КоА Ацетил-КоА
При выращивании дрожжей на н-парафинах нефти в приготовленную из них питательную среду добавляют макро- и микроэлементы, необходимые витамины и аминокислоты[13]. Высушенная дрожжевая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат (БВК), содержащий до 50-60% белковых веществ, для кормления сельскохозяйственных животных.
Хорошим субстратом для выращивания кормовых дрожжей является молочная сыворотка - производственный отход при переработке молока. В качестве источников углерода дрожжевые клетки могут использовать и низшие спирты - метанол и этанол, получаемые в биотехнологии из природного газа или растительных отходов. Дрожжевая масса, полученная после культивирования дрожжей на спиртах, содержит больше белков (56-62% от сухой массы) и меньше вредных примесей, чем кормовые дрожжи, выращенные на н-парафинах нефти, такие, как производные бензола, D-аминокислоты, аномальные липиды, токсины и канцерогенные вещества. Вместе с тем белки дрожжей частично не сбалансированы по метионину, в них мало цистеина и селенцистеина.
Наряду с технологией использования дрожжевых белков в качестве кормовой добавки в рационы сельскохозяйственных животных разработаны технологии получения из них пищевых белков. Важный резерв пищевого белка и витаминов - остаточные пивные дрожжи Saccharomyces carlsbergensis. Организм человека усваивает свыше 90% всех питательных веществ, содержащихся в них. Пивные дрожжи могут с успехом применяться при производстве колбас в качестве заменителя казеина. Белки дрожжей применяют также при получении искусственного мяса. Для этого их нагревают с последующим быстрым охлаждением или продавливанием белковой пасты через отверстия малого диаметра.
Известно более 30 видов бактерий, которые могут быть применены в качестве источников полноценного кормового белка. Бактериальные белковые концентраты с содержанием сырого белка 60-80% (от сухой массы) - ценные препараты в кормопроизводстве. Следует отметить, что бактерии значительно быстрее, чем дрожжевые клетки, наращивают биомассу и, кроме того, белки бактерий содержат больше цистеина и метионина, что позволяет отнести их в разряд белков с высокой биологической ценностью. Источником углерода при культивировании бактерий могут служить природный и попутный газы, водород, а также спирты - метанол, этанол, пропанол. К числу бактерий с высокой интенсивностью синтеза белков следует отнести и водородокисляющие бактерии, способные накапливать в клетках до 80% сырого белка. Для их культивирования в составе газовой среды обычно содержится 70-80% водорода, 20-30% кислорода и 3-5% СО2.
Для получения кормового белка используют одноклеточные водоросли Chlorella и Scenedesmus, сине-зеленые водоросли из рода Spirulina, способные синтезировать белки из диоксида углерода, воды и минеральных веществ за счет энергии солнечного света. Водоросли для своего развития нуждаются в определенных режимах освещения и температуры и в больших объемах воды. Обычно их выращивают в естественных условиях южных регионов в бассейнах открытого типа. При выращивании водорослей в культиваторах открытого типа с 1 га водной поверхности можно получать до 70 т сухой биомассы в год, что превышает выход биомассы при возделывании пшеницы, риса, сои, кукурузы. Белки водорослей хорошо сбалансированы по содержанию незаменимых аминокислот, за исключением метионина. В клетках водорослей, кроме того, синтезируется довольно много полиненасыщенных жирных кислот и ?-каротина.
В биомассе многих микроскопических грибов хорошо сбалансированы по аминокислотному составу белки; они включают также витамины и липиды. По своим питательным свойствам белки грибов приближаются к белкам сои и мяса, что позволяет использовать из не только для приготовления кормовых концентратов, но и как добавку в пищу человека. Источником углерода для промышленного выращивания микроскопических грибов служат растительные отходы, содержащие клетчатку, гемицеллюлозы, лигнин, а также торф и навоз. В Великобритании создан пищевой продукт, основным компонентом которого является белок грибного происхождения - микопротеин на дешевом глюкозном сиропе, полученном путем гидролиза пшеничного или кукурузного крахмала.
1.3 Основы инженерной энзимологии
Применение ферментов
Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) и вне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике. Биологические катализаторы нетоксичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи с чем, их применение в промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения. По объему производства ферменты занимают третье место после аминокислот и антибиотиков. Из более чем 2000 известных в настоящее время ферментов в промышленности используется около 30.
Таблица 2. Применение ферментов
Название фермента | Источники фермента | Химический и биологический процессы. Область использования. | |
Амилазы | Bacillus sp., Aspergillus niger | Гидролиз крахмала до декстринов, мальтозы и глюкозы. Спиртовая, пивоваренная промышленность, хлебопечение, получение патоки, глюкозы. | |
Глюкоизомераза | Более 80 видов микроорганизмов | Изомеризация D-глюкозы в D-фруктозу. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, хлебопечение. | |
Глюкооксидаза | Penecillium chrysogenum, Aspergillus niger | Удаление кислорода и глюкозы (из яичного порошка, мясных и других продуктов). Виноделие, пивоваренная, консервная, соковая и безалкогольная промышленность. | |
Липазы | Поджелудочные железы животных, семена растений, микроорганизмы | Гидролиз жиров и масел. Пищевая, легкая, медицинская промышленность, сельское хозяйство, коммунальное хозяйство, бытовая химия. | |
Пектиназа | Многие микроорганизмы (Aspergillus ssp., Fusarium ssp.) | Гидролиз галактуронана, осветление вина и фруктовых соков. | |
Пептидогидролазы | Поджелудочные железы и слизистая желудка животных; плоды, побеги, отходы переработки некоторых растений (дынное дерево, инжир, ананас) | Лизис белка. Получение аминокислот, производство и получение сыра, мягчение мясных и рыбных изделий, выделка кожи, активизация пищеварения. Пивоварение, виноделие, хлебопечение, пищевая промышленность, сельское хозяйство, медицина. | |
Целлюлазы | Clostridium ssp., Aspergillus oryzae, Fusarium culmorum | Гидролиз целлюлозы до глюкозы. Производство пищевых и кормовых белковых препаратов, этанола, глюкозо-фруктозных сиропов. Спиртовая, пивоваренная, пищеконцентратная промышленность, хлебопечение, кормопроизводство. | |
Фруктофуранозидаза | Bacillus subtilis, E. coli, Streptococcus mutans | Инверсия сахарозы. Кондитерская, ликероводочная, безалкогольная промышленность, сиропопроизводство. |
Задачи инженерной энзимологии заключаются в развитии прогрессивных методов выделения ферментов, их стабилизации и иммобилизации; конструировании катализаторов с нужными свойствами и разработке научных основ их применения. В частности, методами белковой инженерии, сущность которых состоит в изменении первичной структуры природной молекулы фермента посредством химической модификации самого энзима или его гена, удается принципиально трансформировать структуру активного центра и его функцию, модулировать субстратную специфичность и физико-химические свойства фермента. Так, замена остатка глутамина-102 в молекуле лактатдегидрогеназы на аргинин превратила фермент в высокоактивную малатдегидрогеназу. Созданы гибридные формы ферментной системы, ценной в иммуноферментном анализе, сочетающие в себе свойства ?-галактозидазы и ?-галактокиназы. Важным этапом развития инженерной энзимологии стала разработка способов получения и использования иммобилизованных ферментов.
Иммобилизованные ферменты
Иммобилизованными ферментами называют ферменты, искусственно связанные с нерастворимым носителем, но сохраняющие свои каталитические свойства[7].
Ещё в 1916 г. Дж. Нельсон и Е. Гриффин показали, что сахараза, сорбированная на угле, сохраняла свою каталитическую активность, но лишь в 1953 г. Н. Грубхофер и Д. Шлейт впервые осуществили ковалентные связывания амилазы, пепсина, РНКазы и карбоксипептидазы с нерастворимым носителем. В 1971 г. на первой конференции по инженерной энзимологии был узаконен термин «иммобилизованные ферменты». Однако в понятие «иммобилизация» в настоящее время вкладывают более широкий смысл, чем связывание на нерастворимом носителе, а именно - полное или частичное ограничение движения белковых молекул.
Иммобилизованные ферменты имеют ряд преимуществ в сравнении со свободными молекулами. Прежде всего, такие ферменты, представляя собой гетерогенные катализаторы, легко отделяются от реакционной среды, могут использоваться многократно и обеспечивают непрерывность каталитического процесса. Иммобилизованные ферменты долговечны и в тысячи и десятки тысяч раз стабильнее свободных энзимов.
По Дж. Порату (1974), идеальные материалы, используемые для иммобилизации ферментов, должны обладать следующими основными свойствами: нерастворимостью; высокой химической и биологической стойкостью; значительной гидрофильностью; достаточной проницаемостью, как для ферментов, так и для коферментов, субстратов и продуктов реакции; способностью носителя легко активироваться (переходить в реакционноспособную форму). В зависимости от природы носители делятся на органические и неорганические материалы.
Иммобилизация многих ферментов осуществляется на полимерных носителях органической природы. Существующие органические полимерные носители можно разделить на два класса: природные и синтетические полимерные носители. Среди природных полимеров выделяют белковые, полисахаридные и липидные носители, а среди синтетических - полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные.
К преимуществу природных носителей следует отнести их доступность, полифункциональность и гидрофильность, а к недостаткам - биодеградируемость и достаточно высокую стоимость. Из полисахаридов для иммобилизации наиболее часто используют целлюлозу, декстран, агарозу и их производные. Для придания химической устойчивости линейные цепи целлюлозы и декстрана поперечно сшивают эпихлоргидрином. Химической модификацией крахмала сшивающими агентами (формальдегид, глиоксаль, глутаровый альдегид) синтезирован новый носитель - губчатый крахмал, обладающий повышенной устойчивостью к гликозидазам. Из природных аминосахаридов в качестве носителей для иммобилизации применяют хитин. Среди белков практическое применение в качестве носителей нашли структурные протеины, такие, как кератин, фиброин, коллаген и продукт переработки коллагена - желатин.
К синтетическим полимерным носителям относятся полимеры на основе стирола, акриловой кислоты, поливинилового спирта; полиамидные и полиуретановые полимеры. Большинство синтетических полимерных носителей обладают механической прочностью, а при образовании обеспечивают возможность варьирования в широких пределах величины пор, введения различных функциональных групп.
В качестве носителей неорганической природы наиболее часто применяют материалы из стекла, глины, керамики, графитовой сажи, силикагеля, а также силохромы, оксиды металлов. Их можно подвергать химической модификации, для чего носители покрывают пленкой оксидов алюминия, титана, гафния, циркония или обрабатывают органическими полимерами. Основное преимущество неорганических носителей - легкость регенерации.
Существуют два принципиально различных метода иммобилизации ферментов: без возникновения ковалентных связей между ферментом и носителем (физические методы иммобилизации) и с образованием ковалентной связи между ними (химические методы иммобилизации).
При адсорбционной иммобилизации белковая молекула удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Адсорбция была первым методом иммобилизации ферментов (Дж. Нельсон, Э. Гриффин, 1916), но и сейчас не потеряла своего значения и стала наиболее широко распространенным способом получения иммобилизованных ферментов в промышленности. Процесс адсорбции ферментов достигается при контакте водного раствора фермента с носителем (статистическим способом, при перемешивании, динамическим способом с использованием колонок). К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания фермента с носителем. При изменении условий иммобилизации могут происходить десорбция фермента, его потеря и загрязнение продуктов реакции.
Способ иммобилизации ферментов путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и уникальности. Метод применим для иммобилизации не только индивидуальных ферментов, но и мультиэнзимных комплексов и даже интактных клеток. Иммобилизацию ферментов в геле осуществляют двумя способами. В первом случае фермент вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами фермента. Во втором случае фермент вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Для первого варианта используют гели полиакриламида, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, силикагеля, для второго - гели крахмала, агар-агара, каррагинана, агарозы, фосфата кальция. Метод непригоден для иммобилизации ферментов, действующих на водонерастворимые субстраты.
Сущность способа иммобилизации ферментов в полупроницаемые структуры заключается в отделении водного раствора фермента от водного раствора субстрата с помощью полупроницаемой мембраны, пропускающей низкомолекулярные молекулы субстратов и кофакторов, но задерживающей большие молекулы фермента. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых интерес представляет микрокапсулирование и включение ферментов в липосомы. Первый способ предложен Т. Чангом в 1964 г. и состоит в том, что водный раствор фермента включается внутрь замкнутой микрокапсулы, стенки которой образованы полупроницаемым полимером. Один из механизмов возникновения мембраны на поверхности водных микрокапсул фермента заключается в реакции межфазной поликонденсации двух соединений, одно из которых растворено в водной, а другое - в органической фазе. Примером может служить образование на поверхности раздела фаз микрокапсулы, получаемой путем поликонденсации гексаметилендиамина - 1,6 (водная фаза) и галогенангидрида себациновой кислоты (органическая фаза).
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9
