Исследование соотношения в мышцах С- и Х-белков в норме и при патологии
2
Федеральное агентство по образованию
Пензенский государственный педагогический университет
им. В.Г. Белинского
Факультет Естественно-географический
Кафедра БиохимииДипломная работаИсследование соотношения в мышцах С- и Х-белков в норме и при патологииСтудент _________________________________________ Швецов Ю.А. подпись Научный руководительЗав. лаб. ИТЭБ РАН, д.б.н., профессор______________Подлубная З.А. подписьНаучный руководительдоц. каф. биохимии, к.б.н.__________________________ Соловьев В.Б. подпись К защите допустить. Протокол № от «____» ___________200_г.Зав. кафедрой _____________________________________ Генгин М.Т. подпись Пенза, 2008 г.содержание
Список использованных сокращений……………………...………………….…4
ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………...……..5
I. обзор литературы…………………………………………………...…………..8
Глава 1. САРКОМЕРНЫЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА тайтинА…………………………………………………………………………….8
1.1 Структура молекулы тайтина и его функции…………….………………8
1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка……..…...10
1.3 Белки семейства тайтина в норме, при адаптации и патологии…….….14
Глава 2. Амилоидозы………………………………………..…….………….…16
2.1. Актуальность проблемы……………………………………………..…...16
2.2. История изучения амилоидозов….……………………………………....17
2.3. Современные представления о строении и формировании амилоидных фибрилл…………………………………………………………………………..19
2.4. Изучение амилоидных фибрилл in vitro……………………………...….25
2.5. Патологические проявления амилоидозов……………………………...30
ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ………………………………………....32
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ………………………………………....32
Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………..……....33
3.1. Экспериментальный и клинический материал…………………...……..33
3.2. Выделение и очистка белковых препаратов…………………...………..33
3.2.1. Очистка С-белка, Х-белка и Н-белка…………...………..........………....35
3.2.2. Выделение тайтина из скелетных мышц………………………...……....35
3.3. Определение концентрации белковых препаратов…………………......34
3.4. Проверка чистоты белковых препаратов………………………...……...35
3.5. Условия формирования амилоидных фибрилл…………………...…….36
3.6. Микроскопические исследования……………………………...………...37
3.6.1 Электронная микроскопия……………………………………………......37
3.6.2. Поляризационная и флуоресцентная микроскопия………………..…...37
3.7. Спектральные методы……………………………………………...……..37
3.7.1. Метод кругового дихроизма…………………………………...………....37
3.7.2. Метод флуоресцентного анализа…………………………………...…....38
3.7.3. Спектрофотометрический метод……………………………..………….38
III. Результаты и обсуждение………………………..………………….……...40
Глава 4. образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина….40
4.1 Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств молекул тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка скелетных мышц кролика…………………………………………………………..……………….40
4.2. Электронно-микроскопическое изучение агрегационных свойств Ав(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка…………….47
4.3. Подтверждение амилоидной природы агрегатов, образуемых белками семейства тайтина (тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка) при их взаимодействии со специфическими красителями на амилоиды Конго красным и тиофлавином Т…………………………………………………......49
4.4. Изучение вторичной структуры тайтина и белков его семейства до и после образования амилоидных фибрилл ……………………....................….53
4.5. Скорость образования амилоидных фибрилл Х-белка..………...…..….55
4.6. Образование амилоидных фибрилл С-белком миокарда человека при ДКМП и С-белком миокарда кролика………………………..……………...…57
Список литературы………………………………………………………….....61
Список использованных сокращений
ДКМП дилатационная кардиомиопатия
ДСН додецилсульфат натрия
ДТТ дитиотреитол
КД круговой дихроизм
кДа килодальтон
КК Конго красный
ЛММ легкий меромиозин
МДа мегадальтон
мкм микрометр
нм нанометр
ТТ тиофлавин Т
УФ ультрафиолет
ЭГТА этиленгликоль бис- (в-аминоэтиловый эфир N,N,N',N-тетрауксусной кислоты)
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
FnIII фибронектин-3-подобный домен
IgC2 иммуноглобулин-С2-подобный домен
PMSF фенилметилсульфонилфторид
л длина волны
м ионная сила
введение
Амилоидозы - большая группа конформационных заболеваний, которая характеризуется отложениями белка в виде нерастворимых фибрилл в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков (Tan & Perys, 1994; Uversky & Fink, 2004). Их накопление разрушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к болезни и летальному исходу. Амилоидные отложения найдены при болезни Альцгеймера, Паркинсона, Дауна, диабете второго типа, наследственной амилоидной полинейропатии, системном амилоидозе и др. (Tan & Perys, 1994; Goedert, 2001; Dobson, 2001).
Известно много белков, образующих амилоидные фибриллы, таких как тау-белок, Ав-пептид, ацилфосфатаза, миоглобин, амилин, транстиретин и другие (Guijarro et al., 1998; Chiti et al., 1999; Fandrich et al., 2001; Uversky & Fink, 2004). Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, образуемые ими амилоидные фибриллы имеют общие свойства: в-складчатую структуру с отдельными в-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями Конго красным и тиофлавином Т (Klunk et al., 1989; Krebs et al., 2005). Важно отметить, что белки-предшественники амилоидов претерпевают трансформацию типа "б-спираль - в-складчатость", необходимую для образования амилоидных фибрилл (Uversky & Fink, 2004).
К сожалению, процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления при болезнях, изучены еще недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов и их свойств, развитие терапевтических методов лечения и предупреждения этих заболеваний, а также разработка их прижизненной диагностики являются актуальными задачами. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность разных клеток и т.д. В наибольшей мере это относится к мышечным амилоидозам как к наименее изученным. Амилоидные отложения найдены при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах в мышцах и кровеносных сосудах, однако их белковая природа до сих пор неизвестна.
Данная работа посвящена изучению способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы. В настоящее время известна большая группа белков семейства тайтина (тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и другие), относящихся к саркомерным белкам поперечно-полосатых мышц позвоночных. Они связаны с миозин-содержащими (толстыми) нитями и составляют 15% от общего количества белка в саркомере. С-белок в быстрых волокнах скелетных мышц и его изоформа Х-белок в медленных волокнах (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983) располагаются на поверхности толстых нитей с периодом 43 нм (Bennett et al., 1986; Soteriou et al1., 1993), связываясь одновременно с тайтином и миозином. Тайтин является продольным элементом саркомерного цитоскелета поперечно-полосатых мышц позвоночных.
Исследования показали, что тайтин и белки его семейства могут выполнять разные функции в саркомере. Предполагается, что они играют существенную роль в миогенезе при сборке толстых нитей и формировании структуры саркомера, участвуют в регуляции актин-миозинового взаимодействия при мышечном сокращении и в процессах сигнализации. Наличие 90% в-складчатой структуры в этих белках создает возможность формирования ими амилоидов. Изучение способности белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы представляет большой интерес в связи с их возможным участием в развитии амилоидозов. Ранее при изучении агрегационных свойств белков, связанных в саркомере с миозиновыми нитями, было обнаружено, что один из них (Х-белок) образует in vitro спирально скрученные ленточные фибриллы (Bennett et al., 1985). Авторы указали на визуальное сходство этих структур с амилоидными фибриллами, образуемыми Ав-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера. Однако разные структурные параметры фибрилл Х-белка заставили авторов сомневаться в этом предположении и, возможно, поэтому тестирование их на амилоидогенность не было проведено. Эти наблюдения и высокое содержание в-складчатой структуры стимулировали наше исследование амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими саркомерными белками семейства тайтина.
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. САРКОМЕРНЫЕ ЦИТОСКЕЛЕТНЫЕ БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА ТАЙТИНА
Сократительным аппаратом мышечной клетки является миофибрилла, которая состоит из наименьших сократительных единиц - саркомеров. Саркомеры расположены друг за другом вдоль оси миофибриллы. Каждый саркомер содержит упорядоченную систему цитоскелетных и сократительных белков и имеет длину 2.5-3.0 мкм (Squire, 1981; Шубникова и др. 2001). Основными сократительными белками саркомера являются миозин, актин и тайтин. Молекулы актина образуют тонкие (актиновые) нити, в состав которого входят также тропомиозин и тропонин. Толстые нити скелетных мышц кроме миозина содержат также другие белки, такие как тайтин, С-белок, Х-белок, Н-белок и др. (рис. 1).
Рис.1. Модифицированная схема саркомера (Gregorio et al., 1999).
1.1 Структура молекулы тайтина и его функции
Тайтин (= коннектин, титин) - гигантский эластичный белок скелетных и сердечных мышц млекопитающих (Maruyama et al., 1977; Wang et al., 1979) с молекулярным весом более 3 МДа (Labeit & Kolmerer, 1995). Он был открыт независимо двумя группами исследователей методом ДСН-гель-электрофореза (Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981). Тайтин является третьим по количеству (после актина и миозина) компонентом саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных. Молекулы тайтина длиной около 1 мкм и шириной 3-4 нм (Trinick et al., 1984; Itoh et al., 1986; Nave et al., 1989; Soteriou et al., 1993; Suzuki et al., 1994; Houmeida et al., 1995; Tskhovrebova & Trinick, 1997) перекрывают половину саркомера от М-линии до Z-линии (рис. 1), простираясь через I- и А-диски саркомера, формируя третью филаментную систему в миофибриллах (Fьrst et al., 1988). NH2-концы молекулы тайтина из смежных саркомеров перекрываются в Z-линии, а СООН-концы перекрываются в М-линии. На каждую половину саркомера приходится по шесть молекул тайтина, которые объединены в А-диске саркомера (Trinick 1981; Liversage et al., 2001) и, предположительно, разделяются на пары или на индивидуальные молекулы в I-диске саркомера (Funatsu et al., 1993).
Исследования последних лет показали, что этот гигантский полипептид имеет различное строение в разных зонах саркомера, что вносит свой вклад в их архитектуру и функционирование. Бульшая часть (~90%) молекулы тайтина состоит из повторяющихся иммуноглобулин-С2-подобных (IgС2) и фибронектин-3-подобных (FnIII) доменов (Labeit & Kolmerer, 1995) с в-складчатой структурой, содержащих около ста аминокислотных остатков (Improta et al., 1996; Muhle-Goll et al., 1998) (рис. 2). Кроме этих доменов тайтин содержит уникальные последовательности, расположенные по всей длине его молекулы: киназный домен вблизи М-линии саркомера; два участка связывания с кальпаиновой протеазой (р94) в I-диске и М-линии саркомера, а также эластичные N2B, N2A и PEVK элементы в I-диске саркомера. В концевых областях молекулы тайтина расположены фосфорилируемые участки.
1.2 Структура и функции молекул С-белка, Х-белка и Н-белка
Предположение о присутствии белков немиозиновой природы в структуре толстых, или миозин-содержащих нитей на основании электронно-микроскопических и рентгеновских исследований высказывались давно (Draper & Hodge 1949; Franzini-Armstrong & Porter 1964; Pepe 1967; Hanson et al., 1971), однако до начала 70-х годов природа этих белков была неизвестна. С-белок, Х-белок и Н-белок были обнаружены с помощью ДСН-гель-электрофореза как минорные примеси в препаратах миозина скелетных мышц кролика (Starr & Offer, 1971). В настоящее время эти белки охарактеризованы, и их количество в саркомере составляет около 5% от массы миозина.
С-белок впервые был выделен из скелетных мышц кролика (Offer et al., 1973). Его количество составляет около 2% от массы миофибрилл и около 4% от массы толстой нити.
Показана способность сердечного С-белка фосфорилироваться разными протеинкиназами в условиях in vivo и in vitro (Jeacocre & England, 1980; Hartzell & Titus, 1982; Hartzell & Glass, 1984; Hartzell, 1985; Lim et al., 1985; Gautel et al., 1995; Mohamed et al., 1998). Молекулярный вес С-белка скелетных мышц по данным ДСН-гель-электрофореза 135 кДа (Yamamoto & Moos, 1983; Starr & Offer, 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующих этот белок, составляет 128.1 кДа (Weber et al., 1993). Аминокислотный состав белка характеризуется довольно высоким содержанием пролина, что коррелирует с низким содержанием б-спирали в его молекуле. Методом седиментации показано, что С-белок связывается с высоким сродством с миозином (Callaway & Bechtel, 1981; Yamamoto & Moos, 1983). Электронно-микроскопические исследования подтвердили это связывание для С-белка: он декорирует реконструируемые миозиновые нити и паракристаллы легкого меромиозина (ЛММ) in vitro (Moos et al., 1975; Starr & Offer, 1978; Safer & Pepe, 1980; Фрейдина и др., 1980; Подлубная, 1981; Podlubnaya et al., 1990). Показана способность С-белка связываться с актином (Moos et al., 1976; Moos et al., 1978; Moos, 1981; Фрейдина и др., 1980) и тайтином (Koretz et al., 1993; Soteriou et al., 1993; Fьrst et al., 1992; Freiburg & Gautel, 1996). При снижении ионной силы ниже физиологических значений (м ? 0.1).
Х-белок содержится в грубых препаратах С-белка, выделенного из миозина хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе (Starr & Offer 1982). Был разработан метод разделения Х- и С-белков с помощью колоночной хроматографии на гидроксиапатите (Starr & Offer 1982; Starr et al., 1979). Молекула Х-белка представляет собой гибкую ниточку длиной около 30-35 нм и диаметром 3-4 нм (Bennett et al., 1985). Молекулярный вес Х-белка скелетных мышц кролика по данным ДСН-гель-электрофореза составляют и 145-152 кДа (Yamamoto & Moos 1983; Starr & Offer 1983), а по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляют 126.5 кДа (Weber et al., 1993).
Аминокислотный состав характеризуется высоким содержанием пролина, что соответствует низкому (4%) содержанию б-спирали.
Н-белок выделен из скелетных мышц кролика, точнее - из грубых препаратов С-белка, хроматографией на гидроксиапатите (Starr & Offer, 1982; 1983). Он составляет 0.3-0.4% от миофибриллярной массы. Молекула Н-белка содержит одну полипептидную цепь с молекулярным весом по данным ДСН-гель-электрофореза ~ 69-74 кДа (Starr & Offer, 1983), а по данным другого метода ~ 86 кДа (Vaughan et al., 1993). Молекулярный вес Н-белка скелетных мышц цыпленка и человека по данным анализа нуклеотидной последовательности генов, кодирующего этот белок, составляет 58.4 кДа и 51.9 кДа, соответственно (Vaughan et al., 1993). Аминокислотный состав Н-белка сходен с аминокислотным составом С-белка, но отличается от последнего более высоким содержанием пролина и аланина и более низким содержанием аспарагиновой кислоты, валина и лизина (Yamamoto, 1984). Молекула Н-белка содержит около 4% б-спирали (Starr & Offer, 1983). Н-белок взаимодействует с миозином и с актином (Starr & Offer, 1983).
