Рис. 4. Образование амилоидных фибрилл: (а) - нативная структура белка, (б) - промежуточное состояние, в котором части полипептидной цепи находятся в ненативной конформации, (в) - полностью развернутое состояние, (г) - образование межмолекулярного в-слоя, опосредованное развернутыми областями приводит к олигомеризации белка, (д) -дальнейшее образование в-складчатой структуры, (е) - образование протофибрилл, (ж) -формирование зрелых фибрилл (Jobansson, 2003).
Чемберлейн в 2000 г. показал, что фибриллы, образованные различными белками, обладают сходными структурными свойствами: все они образованы из протофибриллярных нитей, имеющих 2-5 нм в диаметре и содержащих от двух до пяти в-слоев. При этом размеры протофибрилл никак не связаны с количеством аминокислотных остатков белка-предшественника фибриллообразования. Так протофибриллы SH3 домена, включающего 90 аминокислотных остатков, состоят из двух в-слоев, а лизоцим, состоящий из 130 аминокислотных остатков, образует протофибриллярные нити, содержащие четыре в-слоя (Chamberlain et al., 2000).
2.4. Изучение амилоидных фибрилл in vitro
Первоначально, амилоидные фибриллы изучали, выделяя их из пораженных амилоидных отложений. В настоящее время для изучения амилоидных фибрилл, а также амилоидогенеза их формируют in vitro. Открытие того, что амилоидные фибриллы формируют не только белки, связанные с амилоидозами, значительно расширило эту область исследования (Dobson, 1999). Было показано, что при подходящих условиях образовывать амилоидные фибриллы in vitro могут многие белки, такие как лизоцим, миоглобин, Ав пептид, амилин, тау-белок, хангтингтин, мышечная ацилфосфатаза и др. (Uversky & Fink 2004).
Отмечено, что амилоидогенные белки обладают различными способностями к формированию амилоидов, что отражается также в различной скорости этого процесса. Например, мышечная ацилфосфатаза человека способна формировать аморфные агрегаты после первых часов инкубации и только через 45 дней появляются пучки фибрилл (Chiti et al., 1999) (рис. 6). Ав(1-40)-пептид после 4 часов инкубации образует аморфные агрегаты, и только после 48 часов - длинные фибриллы (Qahwash et al., 2003), а образование фибрилл б-лактальбумина занимает несколько дней (Goers et al., 2002).
За скоростью амилоидогенеза наблюдают с помощью классического амилоидного красителя тиофлавина Т, который специфически взаимодействует с амилоидными фибриллами (Krebs et al., 2005). При взаимодействии тиофлавина Т с амилоидными фибриллами происходит увеличение интенсивности флуоресценции красителя при спектрофлуорометрических измерениях и наблюдается желто-зеленая флуоресценция при флуоресцентно-микроскопических исследованиях. Молекула красителя состоит из бензтиазольного и аминобензольного колец свободно вращающихся вокруг общей С-С связи. Кребс и соавторы показали, что молекула тиофлавина Т связывается с амилоидными фибриллами специфически (Krebs et al., 2005). Они предположили, что связывание происходит в "каналах", которые тянутся вдоль в-слоев (рис. 7). Более того, тиофлавин Т связывается с амилоидными фибриллами так, что их молекулы параллельны друг другу и расположены вдоль длинной оси фибриллы (Krebs et. al., 2005). Было показано, что причиной возрастания интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с амилоидными фибриллами является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы друг относительно друга в возбужденном состоянии (Воропай и др., 2003).
Другой амилоидный краситель Конго красный также специфически взаимодействует с амилоидными фибриллами (Klunk et al., 1989). Конго красный - сульфонированый азокраситель с гидрофобной центральной частью, состоящей из бифенильной группы, расположенной между отрицательно заряженными концами молекулы красителя (рис. 8). При связывании Конго красного с амилоидными фибриллами наблюдается зеленое двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, и это свойство делает Конго красный наиболее используемым красителем для диагностики амилоидов. В спектральных исследованиях регистрируется сдвиг спектра поглощения Конго красного в состоянии, связанном с амилоидными фибриллами, в длинноволновую область спектра, а именно от ~490 нм к ~500 нм.
Рис. 8. Модель связывания Конго красного с амилоидными фибриллами. Показан антипараллельный слой, где каждая пятая цепочка белка имеет одинаковое N-C направление. Поэтому, молекула Конго красного может связываться с таким же типом аминокислоты в обеих полипептидных цепях (первой и пятой, как указано на рисунке). Следующая молекула красителя сможет связаться с третьей и седьмой цепочкой и т.д. (Klunk et al., 1989).
Связывание амилоидных фибрилл с Конго красным зависит от структуры амилоидных фибрилл, а именно от наличия в-складчатой структуры с отдельными в-слоями. Кланк и соавторы предложили модель связывания амилоидных фибрилл с Конго красным посредством связей между двумя отрицательно заряженными сульфоновыми группами Конго красного и двумя положительно заряженными аминокислотными остатками двух отдельных белковых молекул, которые определенным образом ориентированы в в-складчатой структуре фибрилл, образованной посредством бок о бок расположенных отдельных молекул (Klunk et al., 1989). Это означает, что белковые цепочки расположены на расстоянии 4.7 Е. Более того, каждая пятая цепочка расположена от первой на расстоянии 19 Е. Это, приблизительно, соответствует расстоянию между сульфоновыми группами КК (рис. 8). Данная модель показывает специфичность взаимодействия Конго красного с амилоидными фибриллами.
2.5. Патологические проявления амилоидозов
К настоящему времени выделяют следующие формы амилоидозов (Мягкова, 2000):
первичный (идиопатический) амилоидоз - развивается вследствие невыясненных причин;
вторичный (приобретенный) амилоидоз - развивается как осложнение после хронических заболеваний, при которых происходит распад тканей (туберкулез, бронхоэктатическая болезнь, хронический остеомиелит и др.);
наследственный (генетический, семейный) амилоидоз - врожденное нарушение белкового обмена;
старческий амилоидоз.
С другой стороны, амилоидоз разделяют на системный и локальный. Однако классификация системного амилоидоза основана на специфичности основного амилоидного белка.
Внешний вид органов при амилоидозе зависит от степени развития процесса. Если амилоидные отложения небольшие, внешний вид органа изменяется мало и амилоидоз обнаруживается лишь при гистологическом исследовании. При выраженном амилоидозе орган увеличивается в объеме, становиться очень плотным и ломким, а на срезе имеет своеобразный восковидный или сальный вид.
До сих пор остается нерешенным вопрос, касающийся механизма действия амилоидных фибрилл на органы и ткани. Исследования последних лет показали, что амилоидные агрегаты разных белков и пептидов вызывают нарушение жизнедеятельности клеток и их гибель. Как оказалось, цитотоксические свойства проявляют все амилоидные белки (Hashimoto et al., 2003; Qahwash et al., 2003; Sirangelo et al., 2004; Lee et al., 2006), однако неизвестно, чем обусловлена цитотоксичность этих агрегатов - механическим повреждением клеток, связанным с накоплением амилоидных отложений или особым молекулярным механизмом их взаимодействий внутри клетки.
цель исследования
Выяснение способности саркомерных белков семейства тайтина формировать амилоидные фибриллы in vitro.
задачи исследования
1. Изучить агрегационные свойства саркомерных белков семейства тайтина (тайтин, Х-, С- и Н-белки) in vitro.
2. Изучить агрегационные свойства Ав(25-35)-пептида в сравнении с агрегацией молекул Х-белка.
3. Проверить амилоидную природу агрегатов, образуемых исследуемыми белками, поляризационной, флуоресцентной микроскопией и спектральными методами.
4. Изучить скорость образования амилоидных фибрилл.
Глава 3. Материалы и методы исследования
3.1. Экспериментальный и клинический материал
Экспериментальный материал: скелетные мышцы и миокард кролика.
Клинический материал: образцы миокарда пациента при ДКМП, взятые при проведении операции по пересадке сердца. Образцы миокарда человека были предоставлены ФГУ НИИ трансплантологии и искусственных органов Росздрава (г. Москва).
3.2. Выделение и очистка белковых препаратов
3.2.1. Очистка С-белка, Х-белка и Н-белка
Х-белок, С-белок и Н-белок очищали по методу (Offer et al., 1973). Фракции Х-, С- и Н-белков, полученные при хроматографической очистке миозина скелетных мышц на колонке с носителем DEAE-Sephadex А-50, концентрировали сульфатом аммония до степени насыщения 2.08 М и осаждали центрифугированием в течение 1 часа при 3000 g. Осадок растворяли в буфере, содержащем 0.3 M KCl, 4.8 мM K2HPO4, 5.2 мM KH2PO4, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и диализовали против этого буфера до полного удаления сульфата аммония. Разделение белков проводили на колонке с гидроксиапатитом, уравновешенным в этом же буфере, для снятия белков с колонки использовали фосфатный градиент. Такая же процедура очистки применялась и для С-белка миокарда кролика и человека.
3.2.2. Выделение тайтина из скелетных мышц
Тайтин из скелетных мышц кролика выделяли по методу (Soteriou et al., 1993) с модификациями. Мышцы гомогенизировали в 3-х кратном (по отношению к массе мышц) объеме раствора, содержащего 50 мМ KCl, 5 мM ЭГТА, 1 мM NaHCO3,, 1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0. Для уменьшения деградации тайтина в процессе выделения в раствор добавляли набор ингибиторов протеаз: 1 мM PMSF, 20 мкг/мл ингибитора трипсина, 10 мкг/мл леупептина.
Полученный мышечный гомогенат центрифугировали в течение 5-10 минут при 2500 g. Супернатант отбрасывали, а процедуру промывки повторяли 5-6 раз. К промытому осадку добавляли 2-х кратный объем экстрагирующего раствора, содержащего 0.9 М KCl, 2 мM MgCl2, 2 мM ЭГТА, 0.5 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, 1 мM PMSF, 10 мM имидазола-HCl, pH 7.0. Раствор также содержал 40 мкг/мл соевого ингибитора трипсина и 20 мкг/мл леупептина.
Экстракция проводилась на льду при 4?С в течение 10-15 минут при непрерывном перемешивании. Экстракт осветляли в течение 40 минут при 14000 g и супернатант разбавляли в 3 раза охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3, для преципитации актомиозина (конечная ионная сила ~0.2). Через 1 час супернатант осветляли в течение 60 минут при 20000g. Для осаждения тайтина супернатант разбавляли в 5 раз (конечная ионная сила ~0.05) охлажденной бидистиллированной водой, содержащей 0.1 мM ДТТ и 0.1 мM NaN3. Через 40-60 минут осадок, содержащий преимущественно тайтин, собирали центрифугированием в течение 30 минут при 15000 g. Осадок растворяли в минимальном объеме буфера, содержащего 0.6 М KCl, 30 мM KH2PO4, 1 мM ЭГТА, 0.1 мM ДТТ, 0.1 мM NaN3, pH 7.0, и осветляли в течение 60 минут при 20000 g. Тайтин очищали методом гель-фильтрации на колонке с носителем Sepharose-CL2B, уравновешенным в этом же буфере.
3.3. Определение концентрации белковых препаратов
Концентрацию белков определяли спектрофотометрически с помощью спектрофотометра SPECOD UV VIS, используя следующие значения коэффициентов экстинции (Е2801 мг/мл): 0.543 для доколоночного миозина (Kielley & Harrington, 1960); 0.52 для колоночного миозина (Godfrey & Harrington, 1970); 1.08 для актина (Rees & Young, 1967); 1.37 для тайтина (Trinick et al., 1984); 1.09 для Х-белка, С-белка и Н-белка (Starr & Offer, 1982).
3.4. Проверка чистоты белковых препаратов
Чистоту выделенных препаратов миозина и актина скелетных мышц кролика проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза в 13% полиакриламидном геле по методу (Laemmli, 1970).
Чистоту тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка проверяли с помощью ДСН-гель-электрофореза по методу (Fritz et al., 1989) с модификациями. Согласно нашей методике, разделяющий гель содержал 7% полиакриламида вместо 15%, а также 0.75 М трис-HCl буфер, pH 8.8, 0.1% ДСН, 10% глицерина, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Кроме этого, вместо концентрирующего геля с содержанием полиакриламида 5% согласно (Fritz et al., 1989) применялся концентрирующий гель по методу (Laemmli et al., 1970), содержащий 2.6-2.8% полиакриламида (соотношение акриламида к бис-акриламиду 36.5:1). Эти модификации способствовали лучшему фокусированию белковых полос в геле. Концентрирующий гель также содержал 0.125 М трис-HCl буфер, pH 6.8, 0.1% ДСН, 0.05% тетраметилэтилендиамина и 0.05% персульфата аммония. Модифицированный нами метод ДСН-гель-электрофореза позволил проводить электрофоретическое разделение белков с молекулярным весом от 3 МДа до 100 кДа, что дало возможность исследовать совместное поведение тайтина, Х-белка, С-белка и Н-белка.
Электродный буфер при проведении электрофореза содержал 0.192 М глицина, 0.025 М трис и 0.1% ДСН, рН 8.3. Электрофорез проводили при токе 3-5 мА первые 30-60 минут, после этого поднимали напряжение до 12-15 мА. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 10% этанола и 10% уксусной кислоты, в течение 20-30 минут. Затем гели окрашивали в течение 30-40 минут в растворе, содержащем 0.1% кумасси G-250 и R-250 (смешанных в пропорции 1:1), 45% этанола и 10% уксусной кислоты. Отмывка окрашенных гелей проводилась в 7% уксусной кислоте при постоянном перемешивании на качалке в течение 40-50 мин.
3.5. Условия формирования амилоидных фибрилл
Амилоиды формировали диализом растворов белков в течение 20 часов при 4-37°С против растворов, содержащих: 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0; 0.15 М глицин-KOH, рН 7.5; 25 мМ NaCI, 10 мМ Hepes, pH 7.0; 50 мM NaCl, 10 мM Hepes, pH 7.0; 30 мМ MgCI2, 10 мМ имидазола, pH 7.0; 50 мM MgCl2, 10 мM имидазола, pH 7.0.
Для исследования скорости амилоидообразования раствор Х-белка диализовали против буфера, содержащего 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4?С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для электронно-микроскопических и спектральных исследований. Для экспериментов по исследованию цитотоксичности амилоидных образований Х-белок также инкубировали в растворе, содержащем 30 мМ KCl, 10 мМ имидазола, рН 7.0 при температуре 4?С.
3.6. Микроскопические исследования
3.6.1 Электронная микроскопия
Для приготовления электронно-микроскопических образцов использовали препараты белков с концентрациями 0.1 мг/мл. Каплю раствора или суспензии белка наносили на медные сетки, покрытые коллодиевой пленкой (2% коллодий в амилацетате фирмы SPI-CHEM, USA), укрепленной углеродом. После удаления избытка суспензии полоской фильтровальной бумаги образцы окрашивали 2% водным раствором уранилацетата.
Электронно-микроскопические исследования проводили на микроскопе JEM-100В при ускоряющем напряжении 80 кВ и увеличении 30000х. Увеличение микроскопа было тестировано по паракристаллам парамиозина с периодичностью 14.5 нм.
3.6.2. Поляризационная и флуоресцентная микроскопия
Исследуемые образцы, наносились на предметные стекла и высушивались на воздухе. Образовавшиеся белковые пленки окрашивались 1% водным раствором Конго красного (фирма SIGMA, USA) и затем исследовались на поляризационном микроскопе МКУ-1. Образцы также окрашивались 1% водным раствором тиофлавина Т (фирма SIGMA, USA) и исследовались с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И 3.
3.7. Спектральные методы
3.7.1. Метод кругового дихроизма
Исследование вторичной структуры белка проводили методом кругового дихроизма. Спектры кругового дихроизма исследуемых белков, до и после образования ими фибрилл, регистрировали на спектрополяриметре Jasco J-600, используя кварцевые кюветы с оптической длиной 0.1 см. Спектры КД были измерены в области 200-250 нм. Обсчет спектров КД в далекой ультрафиолетовой области производился с использованием программы CONTINLL (http://lamar.colostate.edu/~sreeram/CDPro/).
3.7.2. Метод флуоресцентного анализа
Исследование амилоидной природы фибрилл, а также исследование скорости амилоидообразования было проведено с использованием классического флуоресцентного красителя амилоидных структур тиофлавина Т (ТТ). Измерения флуоресценции проводили в растворе красителя (250 мкл) и суспензии фибрилл (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Интенсивность флуоресценции раствора регистрировали с помощью спектрофлуориметра PERKIN-ELMER - 44B при длине волны 488 нм и при длине волны возбуждения 420 нм. Ширина щели при возбуждении 5 нм, а при регистрации 10 нм. Из полученных значений интенсивности флуоресценции тиофлавина Т в буфере в присутствии белка вычитали значения интенсивности флуоресценции ТТ в буфере в отсутствие белка, получая интенсивность флуоресценции ТТ, связанного с белком.
3.7.3. Спектрофотометрический метод
Для подтверждения амилоидной природы фибрилл был также использован специфический краситель Конго красный (КК). Суспензию фибрилл (250 мкл) добавляли к раствору КК (250 мкл) в соответствующем буфере (буфер указан в подписях под рисунками в изложении результатов). Молярное соотношение белка к красителю составляло 2:1. Спектры поглощения КК в отсутствие и в присутствии белка регистрировали при 450-650 нм с помощью спектрофотометра SPECORD M 40.
III. Результаты и обсуждение
Глава 4. образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина
