Методы микробиологической диагностики
2
Содержание:
1. ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………2
2. Организация лабораторной микробиологической службы..2
3. Принципы микробиологической диагностики инфекционных заболеваний……………………………………………4
4. Методы выделения и идентификации бактерий…………………5
5. Методы идентификации нуклеиновых кислот…………………19
6. Методы обнаружения вирусов…………………………………………23
7. Методы дианостики грибковых инфекций……………………….27
8. Методы обнаружения простейших…………………………………..29
9. ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………………………………….30
Литература……………………………………………………………………………………31
Введение
Микробиологическая диагностика в первую очередь необходима для определения причины инфекционных заболеваний. Существует 5 основных методов лабораторной диагностики: микроскопический, бактериологический, биологический, серологический и аллергический. Их принципы мы и рассмотрим в данном реферате. Также рассмотрим вопросы организации лабораторной микробиологической службы, методы выделения и иденти-фикации бактерий, обнаружения вирусов, грибов и простейших. Данная тема очень актуальна в наше время, так как с развитием общества и с увеличением численности населения все более масштабным становится распространение инфекций и своевременное обнаружение их носителей способно предотвратить возникновение эпидемий. Благо сейчас биологи уже способны определить множество инфекций, но, сколько ещё не найдено!!! А обнаружение новых микроорганизмов, вызывающих заболевания, позволяет своевременно найти способ лечения. Так что есть ещё простор для мысли и опытов. Думаю, самое время перейти к уже известным нам способам распознавания микроорганизмов. Начнём с места проведения диагностики: с лабораторий.
ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБЫ
Объект изучения медицинских микробиологических лаборато-рий -- патогенные биологические агенты (ПБА) -- патоген-ные для человека микроорганизмы (вирусы, бактерии, грибы, про-стейшие), генно-инженерно модифицированные микроорганизмы, яды биологического происхождения (токсины), гельминты, а также ма-териал (включая кровь, биологические жидкости и экскременты организма человека), подозрительный на содержание ПБА. В зави-симости от выполняемых исследований, микробиологические лабо-ратории подразделяют на диагностические, производственные и научно-исследовательские. В соответствии с типами микроор-ганизмов, изучаемых в них, выделяют бактериологические, ви-русологические, микологические и протозоологические ла-боратории. С возбудителями инфекционных заболеваний работа-ют только в специализированных лабораториях, обеспечивающих безопасность её персонала и невозможность «утечки» патогенных микроорганизмов за пределы лаборатории.
Группы возбудителей инфекционных заболеванийРегламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четы-ре группы возбудителей.Группа I: возбудители особо опасных инфекций: чума, натураль-ная оспа, лихорадки Ласса, Эбола и др.Группа II: возбудители высококонтагиозных бактериальных гриб-ковых и вирусных инфекций: сибирская язва, холера, лихорадка Скалистых гор, сыпной тиф, бластомикоз, бешенство и др. В эту группу также включён ботулотоксин (но не сам возбудитель ботулизма).Группа III: возбудители бактериальных грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выде-ленных в отдельные нозологические формы (возбудители коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, кандидоза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита и др.). В эту группу также включены аттенуированные штаммы бактерий групп I, II и III.Группа IV: возбудители бактериальных, вирусных, грибковых септицемии, менингитов, пнев-моний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений (возбудители анаэробных газовых инфекций, синегнойной инфекции, аспергиллёза, амебиаза, аденовирусы, герпесвирусы и др.).Лаборатории разных групп рискаВ зависимости от уровня безопасности работы с микроорганизмами лаборатории подразделя-ют на четыре группы риска. Первая группа риска: лаборатории особого режима (максимально изолированные) с высоким индивидуальным и общественным риском. Вторая группа риска: режимные лаборатории (изолированные) с высоким индивидуальным и низким общественным риском.Третья группа риска: базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и ограни-ченным общественным риском.Четвёртая группа риска: базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и общест-венным риском.Бактериологические лабораторииВ системе Министерства здравоохранения и Государственного комитета санитарно-эпидемио-логического надзора РФ наиболее разветвлена сеть бактериологических лабораторий. В соот-ветствии с выполняемыми задачами выделяют:бактериологические лаборатории в составе ЛПУ;бактериологические лаборатории в составе комитетов Госсанэпиднадзора;учебные бактериологические лаборатории вузов;проблемные и отраслевые бактериологические лаборатории научно-исследовательских инсти-тутов и предприятий по выпуску бактерийных препаратов;специализированные бактериологические лаборатории по контролю за особо опасными ин-фекциями;специализированные бактериологические лаборатории по контролю за отдельными группами бактерий: микобактериями, риккетсиями, лептоспирами и др.Большая часть микробиологических лабораторий работает с ПБА групп III и IV, а изуче-нием возбудителей особо опасных инфекций (группы I и II) занимаются только специализи-рованные лаборатории.Требования к организации работы с ПБА групп опасности III и IVБазовые лаборатории, работающие с ПБА групп III и IV, должны располагаться в отдельном здании или в изолированной части здания. Они должны иметь два выхода: один для сотрудников, другой -- для доставки материала для исследований (допускается передача материала через пере-даточное окно). В лабораториях вузов, научно-исследовательских институтов и на предприятиях по выпуску бактерийных препаратов допускается наличие одного входа. Лаборатории должны иметь необходимый набор помещений в соответствии с производственной мощностью и номенкла-турой выполняемых исследований. В них должны быть проведены водопровод, электричество, отопление и вентиляция. В системе водоснабжения должны быть предусмотрены раздельные сети подачи воды для лабораторных исследований и бытовых нужд (сеть питьевой воды). Последняя должна быть защищена от обратного тока воды из лабораторной сети. Вентиляция должна быть приточно-вытяжной, при этом наиболее низкое давление вытяжной вентиляции должно быть в помещениях с наибольшей опасностью инфицирования. При необходимости вентиляцию следует оснастить фильтрами тонкой очистки воздуха. Помещения должны иметь естественное и искусст-венное освещение. Каждая лаборатория должна иметь «чистую» и «грязную» зоны. Их планиров-ка и размещение оборудования должны обеспечивать «проточность>> продвижения ПБА по «грязной» зоне.«Грязная» зона включает помещения для приёма и регистрации материала, боксы и комнаты для проведения микробиологических исследований, помещения для проведения серологических исследований, комната для проведения люминесцентной микроскопии, термостатная, автоклавная для обеззараживания материала. Окна и двери всех помещений должны герметично закрываться. Приточно-вытяжная вентиляция «грязной» зоны должна быть оборудована фильтрами тонкой очистки выбрасываемого воздуха. Помещения для проведения работ с живыми ПБА долж-ны быть оборудованы бактерицидными лампами. Обязательна маркировка автоклавов, столов, стеллажей для чистого и инфицированного материала. Покрытие лабораторной мебели, поверх-ности пола, стен и потолка должны быть гладкими и устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств.«Чистая» зона включает гардероб для верхней одежды, комнаты отдыха, комнату для работы с документацией, комнату для надевания рабочей одежды, подсобные помещения, душевую, туалет, помещения для предварительных работ (препараторская, моечная, комната приготов-ления и разлива питательных сред и др.), стерилизационную, помещения с холодильниками для хранения питательных сред и диагностических препаратов. В «чистой» зоне возможна работа с неживыми ПБА (серологические и биохимические исследования).Требования к проведению работ в микробиологической лабораторииРаботу с ПБА групп III и IV выполняют специалисты с высшим и средним специальным образованием. К ней допускают сотрудников, прошедших инструктаж по соблюдению требований безопасности работы с ПБА; последующий инструктаж следует проводить не реже одного раза в год. Все сотрудники, работающие с ПБА, должны находиться на диспансерном учёте. Приборы, оборудование и средства измерения должны быть аттестованы, технически исправны и иметь технический паспорт. Их метрологический контроль и техническое освидетельствование следует проводить в установленные сроки.Из правил работы в «грязной зоне» базовой лаборатории:Использование спецодежды и средств индивидуальной защиты. Перед работой следует проверить качество посуды, пипеток, шприцев и другого оборудования. При пипетировании необходимо пользоваться только резиновыми грушами или автоматическими устройства-ми. Строго запрещено пипетировать материал ртом, переливать его через край сосуда (про-бирки, колбы), а также оставлять без надзора рабочее место во время выполнения любых работ с ПБА. В грязной зоне запрещается курить, пить воду, хранить верхнюю одежду, головные уборы, обувь, пищевые продукты. В помещения зоны нельзя приводить детей и домашних животных.После окончания работы все объекты, содержащие ПБА, должны быть убраны в хранилища (холодильники, термостаты, шкафы) с обязательной дезинфекцией столов. Использованные пипетки полностью (вертикально) погружают в дезинфицирующий раствор, избегая образо-вания пузырьков в каналах. Остатки ПБА, использованную посуду и оборудование собирают в закрывающиеся ёмкости и передают в автоклавную. Категорически запрещено сливать отходы с ПБА в канализацию без предварительного обеззараживания. После окончания ра-боты с ПБА и заражёнными животными, а также после ухода из лаборатории следует тща-тельно вымыть руки.ПРИНЦИПЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙЦель микробиологических исследований -- установить факт наличия или отсутствия возбудителя в организме больного и на объектах окружающей среды.Задачи микробиологических исследований -- идентифицировать микроорганизмы в ис-следуемом материале, определить их видовую принадлежность, морфологические, биохимические, токсигенные и антигенные свойства, а также установить чувствительность выделенных микроорга-низмов к антимикробным препаратам. Несмотря на то, что проведение микробиологических исследо-ваний относится к компетенции микробиологов, каждый врач, имеющий дело с инфекционными заболеваниями, должен знать, как и когда необходимо отбирать материал для исследований, на какие исследования его направлять и как интерпретировать полученные результаты. Отбор материала.Первый этап любого микробиологического исследования составляет правильный выбор материала для исследования. Его определяют свойства возбудителя и патогенез вызываемого им заболевания. При поражениях отдельных органов и систем целесообразно отбирать материал соответст-вующей локализации. При отсутствии поражений исследуют кровь, а затем отбирают образцы с учётом клинической картины заболевания и доступности материала для исследования. Так, при лихорадке неясного генеза первоначально проводят посев крови; затем, при появлении симптомов более конкретных проявлений, например пневмонии, проводят забор мокроты.Образцы следует забирать до назначения антимикробной терапии, с соблюдением правил асептики для предупреждения загрязнения материала. Каждый образец следует рассматривать как потенциально опасный. При заборе, транспортировке, хранении и работе с ним необходимо соблюдать правила биологической безопасности. Материал собирают в объёме достаточном для всего комплекса исследований. Микробиологические исследования следует начинать немедленно после поступления образца в лабораторию.Выбор материала для исследования должен соответствовать характеру инфекционного процесса. Так, например, при установлении этиологии пневмонии материалом должна быть мок-рота, а не слюна, а при раневых инфекциях отделяемое следует забирать из глубины раны, а не с её поверхности.Выбор лабораторных исследованийОснову микробиологической диагностики инфекционных заболеваний составляют микроско-пические, микробиологические, биологические, серологические и аллергологические методы.Микроскопические методыМикроскопические методы включают приготовление мазков и препаратов для микроскопирования. В большинстве случаев результаты микроскопических исследований носит ориенти-ровочный характер (например, определяют отношение возбудителей к окраске), так как мно-гие микроорганизмы лишены морфологических и тинкториальных особенностей. Тем не менее микроскопией материала можно определить некоторые морфологические признаки возбудите-лей (наличие ядер, жгутиков, внутриклеточных включений и т.д.), а также установить факт наличия или отсутствия микроорганизмов в присланных образцах.Микробиологические методыМикробиологические методы -- «золотой стандарт» микробиологической диагностики, так как результаты микробиологических исследований позволяют точно установить факт нали-чия возбудителя в исследуемом материале. Идентификацию чистых культур (до вида микроор-ганизма) проводят с учётом морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимичес-ких, токсигенных и антигенных свойств микроорганизма. Большинство исследований включает определение чувствительности к антимикробным препаратам у выделенного возбудителя. Для эпидемиологической оценки роли микроорганизма проводят внутривидовую идентификацию определением фаговаров, биоваров, резистентваров и т.д.Биологические методы Биологические методы направлены на определение наличия токсинов возбудителя в исследу-емом материале и на обнаружение возбудителя (особенно при незначительном исходном содер-жании в исследуемом образце). Методы включают заражение лабораторных животных исследуе-мым материалом с последующим выделением чистой культуры патогена, либо установлением факта присутствия микробного токсина и его природы. Моделирование экспериментальных инфекций у чувствительных животных -- важный инструмент изучения патогенеза заболева-ния и характера взаимодействий внутри системы микроорганизм-макроорганизм. Для проведе-ния биологических проб используют только здоровых животных определённых массы тела и возраста. Инфекционный материал вводят внутрь, в дыхательные пути, внутрибрюшинно, внут-ривенно, внутримышечно, внутрикожно и подкожно, в переднюю камеру глаза, через трепанационное отверстие черепа, субокципитально (в большую цистерну головного мозга). У живот-ных прижизненно забирают кровь, экссудат из брюшины, после гибели -- кровь, кусочки раз-личных органон, СМЖ, экссудат из различных полостей. Серологические методыСерологические методы выявления специфических АТ и Аг возбудителя - важный инструмент в диагностике инфекционных заболеваний. Особую ценность они имеют в тех случаях, когда выделить возбудитель не представляется возможности. При этом необходимо выявить повышение титров АТ, в связи с чем исследуют парные образцы сыворотки, взятые в интервале 10-20 суток (иногда этот интервал может быть более длительным). АТ обычно появляются в крови на 1-2-ю неделю заболевания и циркулируют в организме относительно долго, что позволяет использовать их выявление для ретроспективных эпидемиологических исследований. Определение классов lg чётко характеризует этапы инфекционного процесса, а также может служить косвенным прогностическим критерием. Особое значение имеют методы выявления микробных Аг. В значимых количествах они появляются уже на самых ранних сроках, что делает их идентификацию важным инструментом экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, а количественное их определение в динамике инфекционного процесса служит критерием эффективности проводимой антимикробной терапии.Аллергологические методыАг многих возбудителей обладают сенсибилизирующим действием, что используют для диагностики инфекционных заболеваний, а также при проведении эпидемиологических исследований. Наибольшее распространение нашли кожно-аллергические пробы, включающие внутрикожное введение Аг (аллергена) с развитием реакции ГЗТ. Кожные пробы нашли применение в дианостике таких заболеваний как сап, мелиодиоз, бруцеллёз. Наиболее известна проба Манту. Используемая как для диагностики туберкулёза, так и для оценки невосприимчивости организма к возбудителю.МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙМикроскопия материала
Любое бактериологическое исследование начинается с микроскопии материала и его последующего посева на питательные среды. Эффективность выделения возбудителя в значительной степени обусловлена правильной техникой отбора образцов клинического материала, своевре-менностью их доставки в лабораторию и правильным хранением образцов.
СВЕТООПТИЧЕСКАЯ МИКРОСКОПИЯ
Для световой микроскопии применяют микроскоп -- оптический прибор, позволяющий наблюдать мелкие объекты (рис. 1-1). Увеличение изображения достигают системой линз конденсора, объектива и окуляра. Конденсор, расположенный между источником света и изучаемым объектом, собирает лучи света в поле микроскопа. Объектив создаёт изображение поля микроскопа внутри тубуса. Окуляр увеличивает это изображение и делает возможным его восприятие глазом. Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние, на кото-ром различимы два объекта) определяется длиной световой волны и апертурой линз. Теорети-чески возможный предел разрешения светового микроскопа равен 0,2 мкм; реальное разреше-ние можно повысить за счёт увеличения апертуры оптической системы, например путём уве-личения коэффициента преломления. Коэффициент преломления (иммерсии) жидких сред больше коэффициента преломления воздуха («=1,0), при микроскопировании применяют несколько иммерсионных сред: масляную, глицериновую, водную. Механическая часть мик-роскопа включает штатив, предметный столик, макро- и микрометрический винты, тубус, тубусодержатель.
Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые бактерии. Для этого используют темнопольный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Перед началом работы свет устанавливают и центрируют по светлому полю, затем светлопольный конденсор удаляют и заменяют соответствующей системой (например, ОИ-10 или ОИ-21). Пре-парат готовят по методу «раздавленной капли», делая его как можно более тонким (толщина покровного стекла не должна быть толще 1 мм). Наблюдаемый объект выглядит как освещен-ный на тёмном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроско-па поступают только рассеянные лучи (рис. 1-2). В качестве иммерсионной жидкости пригод-но вазелиновое масло.
