Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом
Получение ферментных препаратов выращенных глубинным способом
Содержание
- Введение
- Классификация и номенклатура ферментов и ферментных препаратов
- Характеристика активности ферментных препаратов
- Стандартизация ферментных препаратов
- 1. Общие сведения о глубинном способе производства ферментных препаратов
- 1.1 Принципиальная схема получения ферментных препаратов глубинным способом
- 1.2 Глубинное культивирование микроорганизмов
- 1.3 Получение ферментных препаратов из культур микроорганизмов
- 1.3.1 Принципиальная схема получения ферментных препаратов
- 1.3.2 Технологическая схема получения очищенных ферментных препаратов
- 1.3.3 Получение неочищенных ферментных препаратов
- 1.3.4 Экстрагирование ферментов
- 1.3.5 Концентрирование ферментных растворов методом вакуум-выпаривания
- 1.3.6 Другие промышленные методы очистки, концентрирования и стабилизации ферментных препаратов
- 1.4 Микробиологический и биохимический контроль производства
- 1.5 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препараты
- 2. Производство протеолитических ферментных препаратов
- 2.1 Источники получения протеиназ
- 2.2 Механизм действия, свойства и классификация протеиназ
- 2.3 Получение микробных протеиназ
- 2.3.1 Технологические схемы производства микробных протеиназ
- 2.3.2 Продуценты
- 2.3.3 Регуляция синтеза протеиназ
- 2.3.4 Питательные среды и условия культивирования
- 2.3.5 Выделение ферментов
- 2.4 Производственные стоки
- Введение
- Производство ферментных препаратов занимает одно из ведущих мест в современной биотехнологии и относится к отраслям, объём продукции которых постоянно растёт, а сфера применения неуклонно расширяется. Такое быстрое развитие связано с тем, что ферменты являются высокоактивными, нетоксичными биокатализаторами белкового происхождения, которые широко распространены в природе, без них невозможны осуществление многих биохимических процессов и жизнь в целом.
- Познание роли ферментов для всего живого на Земле послужило основой для становления и развития технологии ферментных препаратов как науки и для создания промышленного производства наиболее широко используемых ферментных препаратов. Применение этих препаратов помогло существенно изменить, интенсифицировать и усовершенствовать многие существующие технологии или даже создать принципиально новые высокоэффективные процессы. Применение ферментных препаратов различной степени очистки позволило не только улучшить показатели и выходы в различных биотехнологических процессах, но позволило усовершенствовать кормопроизводство, повысить усвояемость кормов, сделать более целенаправленным и эффективным действие синтетических моющих средств, улучшить качество косметических препаратов, создать целый арсенал специфических, чувствительных и точных аналитических методов, наладить производство лекарственных и профилактических средств для медицинской промышленности и т. д.
- Большим и неоспоримым достоинством ферментов перед химическими катализаторами является то, что они действуют при нормальном давлении, при температурах от 20 до 70 °С и рН в диапазоне от 4 до 9 и имеют в большинстве случаев исключительно высокую субстратную специфичность, что позволяет в сложной смеси биополимеров направленно воздействовать только на определенные соединения. Все это свидетельствует о том, что производство ферментных препаратов является одним из перспективных направлений в биотехнологии, которое будет и далее интенсивно развиваться и расширяться.
- Традиционно ферментативные препараты получают либо при поверхностном, либо при глубинном способе культивирования продуцента. Глубинный способ ведения процесса имеет ряд существенных преимуществ перед поверхностным культивированием, т. к. позволяет существенно автоматизировать процесс, в ряде случаев значительно сократить объёмы отходов, проводить процесс непрерывно, сократить в 2 - 4 раза площади цехов, а также позволяет использовать анаэробных продуцентов.
Классификация и номенклатура ферментов и ферментных препаратовПо современной классификации все ферменты делятся на шесть основных классов по типу катализируемой реакции: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5) изомеразы и 6) лигазы (синтетазы). Большинство промышленно важных ферментов, потребность в которых определяется десятками тысяч тонн, относятся к третьему классу - гидролазам. Подавляющее количество препаратов, выпускаемых различными фирмами мира, является комплексными, содержащими помимо основного фермента еще значительное количество сопутствующих ферментов и белков. Поэтому в технологии ферментов препараты чаще классифицируют по основному компоненту в смеси ферментов, присутствующих в данном препарате: амилолитические, протеолитические, липолитические и т. д.В нашей стране существует определенная система названия ферментных препаратов, в которой учитываются основной фермент, источник получения и степень очистки. Наименование каждого препарата включает сокращенное название основного фермента, затем добавляется видовое название продуцента и заканчивается название препарата суффиксом «ин». Например, амилолитические препараты, получаемые из культур
Aspergillus oryzae и
Bacillus subtilis называются соответственно амил-ориз-ин (амилоризин) и амил-о-субтил-ин (амилосубтилин). Далее ставится индекс, в котором обозначены способ производства и степень очистки фермента от балластных веществ. При глубинном способе культивирования после названия ставится буква Г, а при поверхностном - П. Если это неочищенная культура продуцента, то далее следует буква х. Между буквами П, Г и х может стоять цифра, обозначающая степень чистоты препарата. Индекс 2 обозначает жидкий неочищенный концентрат исходной культуры; 3 - сухой ферментный препарат, полученный высушиванием распылением неочищенного раствора фермента (экстракт из поверхностной культуры или культуральной жидкости); 10 - сухие препараты, полученные осаждением ферментов органическими растворителями или методом высаливания. Индексы 15, 18, 20 обозначают препараты, частично освобожденные не только от балластных веществ, но и от сопутствующих ферментов. Номенклатура препаратов с индексом выше 20 не используется, так как в этих случаях речь идет о высокоочищенных и даже гомогенных ферментных препаратах, которые именуются в классификации ферментов.
Характеристика активности ферментных препаратовФерменты являются веществами белковой природы, поэтому в смеси с другими белками определить их количество невозможно. Наличие определенного фермента в данном препарате может быть установлено по результатам той реакции, которую катализирует фермент, т. е. по количеству образовавшихся продуктов реакции или уменьшению исходного субстрата. В количественном выражении условно активность фермента определяется по начальной скорости ферментативной реакции. Начальная скорость зависит от многих факторов, наиболее важные из них - температура, концентрация субстрата, рН реакционной смеси и время от начала реакции. Поэтому по предложению Комиссии по ферментам Международного биохимического союза были приняты правила определения активностей препаратов и их выражения в единицах активности.Стандартная единица активности. Эта величина для любого фермента обозначает то количество его, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 мин при заданных регламентированных условиях. На русском и немецком языках эта единица обозначается буквой Е, на английском, французском, итальянском и испанском - U. Часто количество субстрата нельзя выразить числом микромолей, так как точно не известна масса молекулы, например, при действии на белок, крахмал, пектин, целлюлозу. В этих случаях определяют микроэквивалент затронутых реакцией групп. Так, при гидролизе белка учитывают не число прогидролизованных молекул, а число образовавшихся свободных карбоксильных или аминных групп, т. е. число расщепленных пептидных связей; при гидролизе крахмала и полисахаридов - число прогидролизованных глюкозидных связей и т. д.Комиссия по ферментам рекомендовала придерживаться определенных условий при установлении активности фермента: стараться вести определение при температуре 30 °С и определять активность по начальной скорости реакции, когда концентрация субстрата достаточна для насыщения фермента и соответствует кинетике реакции нулевого порядка. Концентрации субстрата, фермента и рН выбирают оптимальными для данного фермента.Если количество прореагировавшего субстрата очень мало или велико, допускается выражение результатов в миллиединицах (мЕ или мU) и килоединицах (кЕ и кU).Активность ферментных препаратов. Содержание фермента в данном препарате условно выражается в стандартных единицах активности фермента на 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата. Активность ферментного препарата выражается в микромолях субстрата, прореагировавшего в присутствии 1 мл ферментного раствора или 1 г препарата в заданных условиях за 1 мин. Число микромолей и будет равно числу стандартных единиц. Если фермент гомогенен, то его удельная активность может быть выражена в стандартных единицах на 1 мг фермента: если же препарат содержит балласт в виде неактивного белка, его удельная активность выражается в стандартных единицах на 1 мг белка в ферментном препарате. Молекулярная активность представляет собой число миллимолей субстрата или эквивалентов затронутой реакцией групп, прореагировавших в течение 1 мин с 1 ммоль фермента при оптимальных концентрациях субстрата, или число стандартных единиц, содержащихся в 1 ммоль фермента.Если фермент содержит характерную простетическую группу или несколько каталитических центров, которые поддаются измерению, его активность можно выразить в величинах активности каталитического центра. Такая активность будет соответствовать молекулярной активности, если молекула фермента имеет один активный центр; если же число каталитических центров
п,
то активность одного центра будет в
п раз меньше молекулярной.Активность условного препарата. В технологии ферментов помимо общепринятых понятий об активности ферментных препаратов принято пользоваться понятием активности условного ферментного препарата. Это необходимо для оценки работы предприятия, сравнения его с другими аналогичными заводами, т. е. для сопоставления показателей по всем видам выпускаемой продукции. Для осуществления этого пересчета предполагают, что предприятие выпускает товарную продукцию в виде стандартного препарата с точно определенной активностью, измеряемой по основному ферменту в стандартных единицах в препарате на единицу массы препарата. Активность основного фермента в таком стандартном условном препарате устанавливается нормативами и называется активностью условного препарата.За 1 усл, т ферментного препарата принимается 1 т препарата со стандартной активностью. Для пересчета выработанной товарной продукции в условные тонны можно пользоваться формулойгде - количество условного препарата, т; - количество товарного препарата, т; - фактическая активность товарного препарата, ед./г; - активность условного препарата, ед./г.
Стандартизация ферментных препаратовОчень часто ферментативная активность партии готового препарата заметно отличается от предыдущих. Потребитель же должен получать препарат с определенной стандартной активностью. Поэтому на основе длительного анализа практической работы предприятий по данной технологии для каждого выпускаемого препарата устанавливается средний уровень активности с запасом 20 - 30 %. Активность стандартного препарата определяется в единицах ФА на 1 г.Для получения постоянной активности в препараты вводится наполнитель в определенном количестве, которое зависит от полученной на данном предприятии активности в культуре и препарате. Желательно, чтобы наполнитель по отношению к ферменту выступал и в роли стабилизатора, а не просто инертного соединения. Важно также учитывать свойство наполнителей сорбировать водяные пары. Так, например, крахмал, добавленный к ферментному препарату, препятствует его увлажнению, а хлористые соли калия и натрия способствуют увлажнению препаратов, поэтому при использовании последних возникает необходимость в герметической упаковке препаратов.Стандартизацию препарата можно проводить, добавляя наполнитель, например, перед концентрированием, если продукт выпускается в жидком виде, или же перед сушкой распылением с учетом потерь на стадии концентрирования или при распылительной сушке, или в уже готовый сухой препарат. При смешивании готового сухого препарата с наполнителем необходимо, чтобы препарат и наполнитель имели приблизительно одну и ту же степень измельчения и влажность не более 10 - 12 %. При перемешивании наполнителя и препарата, например, в шаровой мельнице за 30 - 40 мин получаются вполне однородные ферментные препараты.Количество наполнителя можно рассчитать по формуле,где
S - количество наполнителя, необходимое для получения стандартного по активности препарата, кг;
а - активность исходного препарата, ед. ФА/r;
b - количество исходного препарата, кг;
с - стандартная активность препарата, ед. ФА/г.Известно, что хорошим стабилизатором амилолитических ферментов является крахмал, пектолитических - крахмал или хлористый натрий. Стандартизировать неполитические препараты можно также диатомитом, желатином, бентонитом. Выбор наполнителя и стабилизатора, определение дозировки, необходимых условий хранения и длительности сохранения активности осуществляются экспериментально.
1. Общие сведения о глубинном способе производства ферментных препаратов1.1 Принципиальная схема получения ферментных препаратов глубинным способомОбобщённая схема производства ферментных препаратов при глубинном способе культивирования производственной культуры продуцента. Условно можно выделить три этапа: подготовительный этап (стерилизация оборудования, приготовление среды для культивирования, её стерилизация, подготовка культуры продуцента, инокулирование среды, очистка воздуха), этап получения производственной культуры (ферментация) и получение ферментных препаратов с заданными характеристиками.При сравнении производств ферментативных препаратов, получаемых глубинным способ культивирования, можно отметить, что схемы отличаются в основном на первом и завершающем этапах. Это связано с использованием различных продуцентов и требуемыми качествами ферментативных препаратов. Также можно отметить различные пути использования нерастворимых остатков после этапа производственного культивирования. Он может использоваться для получения биошрота, поступать на культивирование в качестве инокулята или, после соответствующей обработки, входить в состав среды.1.2
Глубинное культивирование микроорганизмов
Этот способ имеет ряд очевидных преимуществ перед поверхностным, так как позволяет значительно сократить производственные площади, исключить тяжелый непроизводительный ручной труд, улучшить гигиену труда, упрощает механизацию и автоматизацию производства, делает возможным переход на непрерывный способ культивирования. При глубинном способе культивирования более рационально используются питательные вещества сред, что дает возможность значительно сократить отходы производства в виде нерастворимых осадков твердой питательной среды, получать препараты ферментов с меньшим содержанием примесей и большей удельной активностью.Глубинное культивирование проводят в вертикальных емкостях различного размера, называемых ферментаторами. Основное требование к ферментатору - возможность проведения процесса культивирования продуцента в асептических условиях при интенсивном аэрировании среды. В процессе культивирования приходится иметь дело со сложной трехфазной системой жидкость - твердая взвесь - газ. В такой системе затруднены массообменные процессы, и поэтому усложняется аппаратурное оформление всей стадии выращивания.Существующие промышленные ферментаторы по способу подвода энергии на аэрирование и перемешивание можно подразделить на три группы: аппараты с механическим перемешиванием и барботажем (комбинированные); с эжекционной системой аэрирования (подвод энергии к жидкой фазе) и барботажные (подвод энергии к газовой фазе). Для ферментной промышленности наибольший интерес представляет первая группа аппаратов, предназначенная для асептических процессов. Эти аппараты в основном имеют цилиндрическую форму и отличаются по объему, конструкции отбойников, перемешивающих устройств, уплотнений вращающегося вала и теплообменным устройствам. Максимальный объем ферментаторов с механическим перемешиванием и пеногашением составляет 2000 м3. Фирма «Хемап» располагает внедрёнными разработками герметичных ферментаторов вместимостью до 360 - 400 м3. Из отечественных аппаратов наиболее широко используются герметизированные ферментаторы вместимостью 50 м3 и вместимостью 100 м3 с механическим перемешиванием и барботажем воздуха. Кроме этих двух ферментаторов на многих ферментных предприятиях работают аппараты вместимостью 63 м3 производства ГДР.Аппараты рассчитаны для работы под избыточным давлением 0,25 МПа и стерилизации при температуре 130 - 140 °С. Во избежание инфицирования культуры предусмотрены торцовые уплотнения вала перемешивающего устройства с паровой защитой. Торцовые уплотнения позволяют практически полностью предотвратить утечку среды или попадание воздуха в полость аппарата в месте выхода из него вала, что очень важно для обеспечения асептических условий процесса.Важным фактором с точки зрения асептики процесса культивирования продуцента является правильная обвязка ферментатора. Под обвязкой подразумевают подвод всех коммуникаций с учетом возможности стерилизации острым паром участков, которые могут явиться источником заражения.Анализ монтажных схем показывает, что они обычно состоят из типовых элементов. Рассмотрим одну из монтажных схем с нижним спуском среды, применяемых в самых различных микробиологических производствах. Ее характерной особенностью является установление термических затворов
3 и
5 для предупреждения проникновения посторонней микрофлоры в аппарат по коммуникациям через неплотности в уплотнениях «седло - клапан» запорной арматуры. В материальные трубопроводы, непосредственно соединенные с внутренней полостью аппарата, постоянно подается пар, а образующаяся пароконденсатная смесь отводится в канализацию или специальное устройство (при наличии открытых трубных окончаний). Как показывает опыт микробиологических производств, такие термические затворы обеспечивают весьма эффективную защиту аппаратов и коммуникаций от инфицирования.В монтажных схемах должен предусматриваться свободный доступ пара во все точки стерилизуемых внутренних полостей аппаратов, трубопроводов и запорной арматуры, что обеспечивает достижение и поддержание требуемой температуры стерилизации. Однако на практике часто одно и то же монтажное оформление коммуникаций и запорной арматуры различного диаметра не обеспечивает равного стерилизующего эффекта. Например, в запорной арматуре и штуцерах малого диаметра требуемой степени стерильности достичь труднее. Ещё большие трудности возникают при термической стерилизации открытых трубных окончаний (пробник
4, штуцер для введения посевного материала
1 трубопровод для удаления отработавшего технологического воздуха
2). Открытые трубные окончания коммуникаций и узлов монтажных схем не позволяют создать в них давление, необходимое для эффективной стерилизации. Использование резиновых шлангов для подключения бутылей и колб с посевным материалом, пробоотборников и ёмкостей с жидкими добавками ещё больше затрудняет процесс стерилизации.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5