звлечение ферментов проводят как из влажных, так и из сухих поверхностных культур грибов. Сухая культура может храниться длительное время без потери активности ферментов, и из нее получают более концентрированные экстракты. Технологически это выгоднее, но при подсушивании культуры имеют место потери активности, и потому экстрагирование целесообразно вести из влажной культуры. При экстрагировании различные водорастворимые вещества извлекаются из культуры с неодинаковой скоростью, происходит их частичное фракционирование, удельная активность ферментов в экстракте повышается в 3,5 - 4 раза по сравнению с исходной культурой в результате отделения большой части веществ (до 75 %) с нерастворимым остатком - биошротом.

На полноту экстрагирования ферментов из культур оказывают влияние многие факторы: температура, рН, длительность процесса, конструктивные особенности экстракционных аппаратов, природа извлекаемого фермента, количество отобранного экстракта с единицы массы загруженной в аппарат культуры и т. д.

Одновременно с ферментами экстрагируются многие другие соединения, и часто скорость извлечения балластных веществ больше скорости экстрагирования из культуры целевого фермента. Поэтому рациональнее пойти на некоторые потери фермента и закончить экстрагирование на оптимальном значении отношения активности фермента в экстракте к сумме извлекаемых веществ. Этот вопрос решается экспериментально для каждого вида продуцента.

Влиять на процесс экстрагирования с помощью такого фактора, как температура, практически невозможно, так как ферменты очень термолабильны и инактивируются даже при 35 - 40 °С (рис. 4). Кроме того, повышение температуры до 35 - 40 °С влечет за собой увеличение содержания сухого вещества в экстракте и уменьшение удельной ферментативной активности на 1 г сухого вещества, повышение опасности инфицирования экстрактов. Поэтому при проведении экстракции в заводских условиях стремятся подавить развитие микрофлоры путем максимального снижения температуры воды до 22 - 25 °С и применения антисептиков (формалин, бензол, толуол, хлороформ и др.). В большинстве случаев ферменты наиболее полно извлекаются при рН 5 - 7.

Для получения концентрированных экстрактов при небольших потерях ферментов с биошротом необходимо применять специальные экстракционные установки. Ранее широко использовались диффузионные батареи (рис. 5). В них можно получить экстракт с содержанием сухого вещества от 7 до 14 % в зависимости от вида культуры, среды и величины отбора экстракта. Но эти установки для экстрагирования ферментов из поверхностной культуры имели сравнительно небольшую производительность, требовали больших затрат ручного труда, и в них наблюдались сравнительно большие потери активности.

Более перспективным в этом отношении является экстрактор непрерывного действия фирмы «Ниро Атомайзер» (Япония), работающий под избыточным давлением (рис. 6). Экстрактор представляет собой наклонную цилиндрическую емкость, снабженную двумя шнеками, теплообменными рубашками и насосами. Культура через дозирующее устройство 5 подается внутрь цилиндра, а с противоположной стороны вводится растворитель (вода). Экстракт выходит из установки через самоочищающийся фильтр, а биошрот удаляется с противоположного конца. В случае необходимости, если ферменты экстрагируются не полностью, можно осуществлять двухступенчатое экстрагирование, увеличивая длительность процесса. Вторичный экстракт может быть использован в качестве растворителя для первой ступени экстрагирования. Общая продолжительность экстрагирования регулируется частотой вращения шнеков. Вторичный биошрот используется как компонент среды или после обеспложивания в кормопроизводстве.

1.3.5 Концентрирование ферментных растворов методом вакуум-выпаривания

Экстракты из поверхностных культур микроорганизмов и фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм технических препаратов (П2х и Г2х) их необходимо сконцентрировать. Чаще всего для этих целей в технологии ферментных препаратов используются методы вакуум-выпаривания. Вакуум-выпаривание также применяется как один из этапов получения сухих технических или очищенных ферментных препаратов. Ферменты очень чувствительны к температуре выпаривания, поэтому основным условием концентрирования ферментных растворов является кратковременное ведение процесса при низких температурах кипения, чтобы выпариваемая жидкость не перегрелась, а ферменты не инактивировались. Следует учитывать, что чем чище раствор, чем меньше он содержит сопутствующих веществ, тем ферменты более чувствительны к воздействию высоких температур (рис. 11). При концентрировании экстрактов из поверхностных культур инактивация ферментов значительно меньше, так как в экстракте содержится очень большое количество защитных соединений, которые препятствуют инактивации ферментов. При концентрировании фильтратов культуральной жидкости наблюдаются несколько большие потери, поэтому ферменты культуральной жидкости стабилизируют различными соединениями (табл. 2). В процессе концентрирования ферментных растворов происходят изменение растворимости многих соединений и выпадение их осадков, и суммарное содержание сухого вещества в концентрате снижается на 11 - 20 %, изменяется рН концентрата (рис. 7). В осадок выпадают минеральные соли, некоторые органические вещества и продукты их распада, наблюдается потеря азота в результате уноса аммиака.

При концентрировании культуральной жидкости В. mesentericus значительно изменяется минеральный состав концентрата. Наиболее резко снижается содержание кальция, меди и магния, заметно уменьшается содержание цинка и марганца. Такое изменение минерального состава культуральной жидкости сказывается на стабильности ферментов в процессе концентрирования (рис. 13, б). При сгущении культуральной жидкости до содержания сухого вещества 10 % количество кальция снижается всего на 5 %, а меди - на 75 %. Известно, например, что медь оказывает на ферменты ингибирующее действие, а кальций - стабилизирующее. Поэтому на первых стадиях концентрирования наблюдается повышение активности ферментов, особенно протеиназ. При более глубоком концентрировании вместе с резким снижением содержания кальция снижается активность ферментов.

Большинство ферментов очень чувствительно к термической обработке и нуждается в мягких режимах концентрирования. На рисунке были приведены данные по инактивации нейтральной протеиназы В. subtilis 103 в зависимости от температуры кипения раствора от 20 до 50 °С и температуры греющего пара от 90 до 120 °С. Из рисунка видно, что очень большое влияние оказывает температура теплоносителя. При низких температурах кипения (25 - 30 °С) происходит заметная инактивация ферментов (до 12 %), если температура греющего пара равна 120 °С. При температуре теплоносителя 90 - 100 °С и температуре кипения 35 - 40 °С потери активности не превышают 10 %. В зависимости от вида продуцента культуральная жидкость имеет различный химический состав и содержит различный комплекс ферментов, поэтому тепловые режимы вакуум-выпаривания уточняются экспериментальным путем.

Суммарные потери активности при вакуум-выпаривании в значительной степени зависят не только от режима концентрирования, но и от конструкции аппарата. Аппараты для стадии вакуум-выпаривания в последние годы значительно усовершенствованы, в десятки раз сокращена длительность процесса, что привело к значительному уменьшению потерь активности ферментов, а также позволило несколько ужесточить температурные режимы концентрирования ферментных растворов. Помимо трубчатых вакуум-выпарных установок с различным расположением трубой (горизонтальным, вертикальным и наклонным), со встроенной и выносной поверхностью нагрева, с использованием принудительной циркуляции созданы новые конструкции пленочных выпарных аппаратов, ультрацентробежных вакуум-выпарных установок и пластинчатых испарителей. Особый интерес представляют ротационные пленочные выпарные аппараты, где упариваемая жидкость в виде пленки движется по внутренней стенке аппарата. Лопатки, смонтированные на вращающемся роторе, непрерывно направляют движение ее сверху вниз. Время прохождения жидкости через аппарат составляет несколько секунд. В настоящее время фирма «Альфа-Лаваль» изготовляет вакуум-выпарные центробежные аппараты типа «Центритерм». Они очень компактны, время контакта ферментного раствора с обогревающей поверхностью предельно сокращено (не более 1 с), потери не превышают 10 %, производительность этих установок от 800 до 4800 л/ч.

Создана центробежная вакуум-выпарная установка пленочного типа производительностью 800 л/ч по испаренной влаге. Время контакта культуральной жидкости с теплоносителем не более 1 с, температура греющего пара 60 - 80 °С. Для увеличения производительности можно монтировать установку из трех модулей, каждый из которых работает либо автономно, либо последовательно, либо первые два модуля работают параллельно и соединены с третьим модулем последовательно. Представляет интерес для ферментной промышленности центробежная пленочного типа вакуум-выпарная установка «Единство» (Югославия) производительностью до 200 л/ч и с температурой упаривания 30 - 40 °С. Хорошие технологические показатели имеют роторные выпарные аппараты фирмы «Люва» (Швейцария), имеющие производительность по испаренной влаге от 50 до 200 л/(м2·ч). Французская фирма APV изготовляет пластинчатые вакуум-выпарные установки производительностью до 20 000 л/ч.

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удается (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

1.3.6 Другие промышленные методы очистки, концентрирования и стабилизации ферментных препаратов

В ферментной промышленности для очистки белков от различных низкомолекулярных примесей (ионов солей, сахаров и т.д.) применяют мембранные методы очистки: диализ и электродиализ и баромембранные методы: обратный осмос, ультрафильтрацию, микрофильтрацию и тонкую фильтрацию.

Также используют осаждение белков органическими растворителями, высаливанием, органическими полимерами и путём избирательной денатурации; разделение белов хроматографическими методами.

Сушка ферментных препаратов имеет целью получить стабильный при хранении ферментный препарат из культуральной жидкости, её концентратов, из пастообразной массы, образующейся при высаливании, осаждении фермента спиртом или другими осадителями и т. д. Для обезвоживания ферментных растворов и осадков применяют сушку в вакуум-сушильных шкафах, распылительных и сублимационных установках. При этом возникает ряд проблем, связанных с большой термолабильностью ферментов.

Получаемые ферменты порой с целью стабилизации иммобилизуют, микрокапсулируют, гранулируют.

1.4 Микробиологический и биохимический контроль производства

Независимо от способа культивирования с момента засева продуцентом стерильной питательной среды ведется контроль за ростом культуры и образованием ферментов. Для каждого вида продуцента и способа культивироваиня устанавливается своя периодичность отбора средних проб растущей культуры. Отобранные пробы подвергаются микроскопированию и визуальному просмотру. С целью выявления возможных заражений производится периодический высев проб на агаризорованные среды с введением факторов, подавляющих рост продуцента. Постоянно ведется определение накопления в культуре ферментативной активности. При глубинном культивировании ведут контроль за потреблением основных лимитирующих компонентов среды (углеводы, N, Р), измеряют рН культуры.

Все показатели роста культуры, изменения состава среды и накопления ферментов и т. д. заносятся в лабораторный журнал.

На всех стадиях выделения ферментов проводят анализы активности, определяют величины потерь и выход товарного продукта. Готовые препараты ферментов подвергают особенно тщательному исследованию, особенно те, которые применяются в медицине и в пищевых продуктах. Препараты медицинского назначения не должны содержать микроорганизмов. Препараты для хлебопекарной, мясной и рыбной промышленности контролируют на содержание спор грибов-продуцентов и на присутствие спороносных бактерий. Споры или клетки продуцента в готовом продукте должны отсутствовать, а предельная норма обсеменённости микрофлорой определяется в каждом конкретном случае. Например, в грибных препаратах из поверхностных культур она не должна превышать 1·105 клеток на 1 г препарата. При контроле готовых препаратов на обсеменённость микроорганизмами делают высевы проб от каждой партии на твердые среды (МПА и сусло-агар) в чашки Петри. Заражение выражается количеством микроорганизмов на 1 г препарата. Контроль на зараженность спороносными бактериями проводится путем высева нагретых до 80 °С проб на чашах Петри с агаризорованной средой. Культивирование для выявления бактериального заражения ведут при 37 °С в течение 24 ч, а для грибного - при 30 °С в течение 48 - 72 ч.

В готовых препаратах определяют влажность и активность в стандартных единицах на 1 г препарата.

Технические жидкие и сухие ферментные препараты анализируют на активность ферментов, содержание сухого вещества и в зависимости от назначения на наличие микробного загрязнения. При контроле высокоочищенных препаратов помимо определения загрязненности микробами и активности ферментов проводятся анализы на содержание белка, зольных элементов, углеводов и других специфических свойств ферментов.

Кроме того, любой ферментный препарат перед промышленным производством подвергают длительной проверке в специальных медицинских учреждениях на токсичность, особенно если препарат предназначен для пищевой и медицинской промышленности. Токсичность препарата зависит от способности микроорганизма синтезировать в процессе жизнедеятельности токсины или канцерогенные вещества, а также от состава используемой для культивирования среды и способов выделения фермента. Исследования на токсичность проводят на лабораторных животных, которым вводят внутримышечно и перорально ферментные препараты в различном виде и дозировке и наблюдают реакцию организма.

Только после тщательного биологического исследования при положительных результатах дается разрешение на промышленное производство препарата и на его применение в пищевой промышленности, медицине, сельском хозяйстве и других областях.

1.5 Охрана труда и техника безопасности на предприятиях, выпускающих ферментные препараты

Инженерные мероприятия являются наиболее важными. Они призваны максимально предотвратить выход и вынос ферментных препаратов в помещения и за пределы предприятия, т. е. исключить контакт с ними человека. Известно также, что в производстве помимо самих ферментных препаратов используется ряд веществ, обладающих токсическими свойствами. Попадая в организм человека, такие вещества могут вызвать отравления и даже профессиональные заболевания.

Степень воздействия различных веществ на организм зависит от дисперсности раздражителя, его концентрации, продолжительности воздействия и путей проникновения в организм. Основными путями проникновения токсических веществ в организм являются органы дыхания (при загрязнении воздуха производственных помещений микроорганизмами - продуцентами, парами, пылью ядовитых веществ и аллергентов), пищеварительный тракт (при приеме пищи в цехе, недостаточно тщательном мытье рук перед едой), а также кожа (при загрязнении ее токсическими веществами и спорами продуцента). На предприятиях, выпускающих ферментные препараты, при использовании поверхностного способа культивирования продуцентов определенную опасность для окружающих представляет воздух заводских помещений, если он загрязнен органической пылью, содержащей отдельные компоненты питательных сред (мелкие частицы отрубей, ростков, опилок и др.), полупродукты производства (культура продуцента), готовую продукцию (мельчайшие частицы порошкообразных препаратов) и, главное, споры и конидии микроорганизмов - продуцентов ферментов. Наиболее тяжелые условия для работающих в цехе хранения и транспортирования сыпучих компонентов сред, приготовления питательных смесей и в цехах, связанных с приготовлением спорового посевного материала, транспортированием и дроблением готовой культуры, а также в производственных помещениях, где проводятся измельчение высушенных осадков ферментов и наполнителей, их смешивание и фасование готовых препаратов. При отсутствии на предприятии специальных герметизирующих устройств в местах пыления и при нарушении нормальной работы приточно-вытяжной вентиляции во всех помещениях содержание органической пыли повышается до 80 - 125 мг/м3, что отрицательно действует на здоровье работающих и может привести даже при более низких концентрациях органической пыли в воздухе к воспламенению и взрыву.

Наибольшая опасность для персонала при поверхностном способе культивирования микроорганизмов - это непосредственный контакт с культурой продуцента. Должна быть точная гарантия в том, что данный микроорганизм не патогенен и что он тщательно обследован перед передачей на производство. При работе с микроорганизмами используются индивидуальные средства защиты, не допускается вход в растильную камеру во время роста культуры, особенно на стадии спорообразования и подсушивания культуры. Отбор проб культуры должен проводиться пробоотборниками, исключающими возможность попадания культуры на кожу работающего. Нарушение правил работы, отсутствие аспирационных и герметизирующих устройств могут способствовать увеличению запыленности воздуха, а при работе с готовой культурой - повышению концентрации спор микроскопических грибов в воздухе до 104 - 105 на 1 м3, что может повлечь за собой заболевание работающих. Наиболее часто отмечаются поражения кожи и слизистых - контактный аллергический дерматит. Часто при прекращении контакта с аллергентом явления дерматита исчезают, но у некоторых лиц наблюдается явление сенсибилизации и при возобновлении работы вновь появляются признаки дерматита.

Основными мерами профилактики в производстве ферментных препаратов являются: максимальная герметизация оборудования и механизация процессов; применение индивидуальных средств защиты (комбинезоны, шлемы-капюшоны, халаты, перчатки, косынки, респираторы); ежедневный теплый душ после работы, обеспыливание, стерилизация рабочей одежды; мытье рук и полоскание рта перед приемом пищи; ежегодные медицинские осмотры; прием во время работы молочного колибактерина или молока. К работе на предприятиях ферментной промышленности нельзя допускать лиц с заболеваниями почек, печени, желудочно-кишечного тракта, легких, а также склонных к кожным болезням.

Уменьшение запыленности заводских помещений достигается путем герметизации оборудования. Если это невозможно по местным условиям, то устанавливают устройства с индивидуальной аспирацией данного узла. Операции, связанные с пылевыделением, необходимо изолировать от других помещений, по возможности механизировать и автоматизировать.

При глубинном культивировании продуцентов ферментов опасность поражения работающих спорами продуцента уменьшается, сокращается число технологических участков, являющихся источником пыли. Тщательного контроля в производствах с этим видом культивирования требуют цех приготовления питательных сред, операции по транспортированию и хранению сыпучих компонентов среды, а также цех получения и измельчения ферментных препаратов.

Особенно большое внимание уделяется на предприятиях, выпускающих ферментные препараты и другие продукты микробного синтеза, вопросам очистки воздуха, используемого для аэрирования растущей культуры перед его выбросом в атмосферу. Повышенная обсеменённость отходящего воздуха может вызвать накопление в атмосфере, прилежащей к заводу, микроорганизмов-продуцентов, что недопустимо. Поэтому весь отходящий воздух должен тщательно очищаться и контролироваться на количество микроорганизмов и их видовой состав. Удаляемый из помещений воздух, загрязненный микроорганизмами, очищают на масляных и обеспложивающих фильтрах типа ФТО-1000 или ФТО-750. Если воздух просто запылен, его очищают на обычных масляных фильтрах, циклонах и рукавных фильтрах.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5

Голосование

Как вы оцениваете работу нашего сайта? Отлично Хорошо Нормально Плохо Результаты