Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди - (диплом)
Дата добавления: март 2006г.
МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО
ОБРАЗОВАНИЯ РФ
НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ФАКУЛЬТЕТ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
Кафедра цитологии и генетики
КЛОНИРОВАНИЕ И АНАЛИЗ ГЕНОВ ЛЕГКИХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ СТЕРЛЯДИ
Дипломная работа
Денисова С. Г.
_____________
Научный руководитель
к. б. н. Таранин А. В.
_____________
Работа выполнена в
лаборатории иммуногенетики
Института цитологии и
генетики СО РАН.
Новосибирск 1997
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................................................................3
ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................................................................................... 4
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................................................................5 СТРОЕНИЕ
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ............................................................................................................................ 5 ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ......................................................................................................7 ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ.................................................................................11 ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ.................................................................................................................................. 19
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................................................................ 24 ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ДНК..................................................................................................................................................................24 ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ................................................................................................................................................. 24 ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ
ЗОНДОВ.........................................................................................................25 ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ
ДНК.................................................................................................................................26 ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl............................................................26
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК............................................................................ 27 ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ................................................................................................. 28 ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ............................................................................... 28 ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК
ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК............................................................................................................................... 28 КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ
кДНК.........................................................................................................29 ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ
РЕАКЦИЯ...................................................................................................................... 33 СУБКЛОНИРОВАНИЕ
ДНК.................................................................................................................................................... 34 СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ
кДНК....................................................................................................................................34 ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК........................................... 35 САУЗЕРН БЛОТ
ГИБРИДИЗАЦИЯ............................................................................................................................... 36
РЕЗУЛЬТАТЫ............................................................................................................................................................................... 38 КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ....................................................... 38
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ.........................................................................................................40 СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ.....................................................................40
АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ.....................................................................................................................41
ОБСУЖДЕНИЕ..............................................................................................................................................................................46
ВЫВОДЫ.............................................................................................................................................................................................. 48
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................................................................................49 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИГ иммуноглобулины
пн пар нуклеотидов
тпн тысяч пар нуклеотидов
е. а. единица активности
ИПТГ изопропилтиогалактозид
ТЕМЕД N, N, N, 'N'-тетраметил-этилен-диамин
трис трис(гидроксиметил)аминометан
дНTФ дезоксиаденозинтрифосфат
ддНТФ дидезоксинеклеотидтрифосфат
дНТФ дезоксинуклеотидтрифосфат
рATФ рибоаденозинтрифосфат
ДТТ дитиотрейтол
Na2ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия SDS додецилсульфат натрия
X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-галактозид
ВВЕДЕНИЕ
В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих лежит сложный комплекс молекулярно-генетических и физиологических механизмов, обеспечивающих реорганизацию, мутагенез и клональную экспрессию генов иммуноглобулинов. Возникновение этой подсистемы иммунитета связывают с появлением хрящевых рыб. На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде повторяющихся кластеров V-J-C генных сегментов. При подобной организации разнообразие продуцируемых антител основывалось, прежде всего, на количестве имевшихся в геноме кластеров, каждый из которых кодировал один вариант полипептидных субъединиц ИГ. В ходе дальнейшей эволюции произошел переход от кластерной к сегментарной организации, обеспечивающей дополнительный источник разнообразия за счет комбинативной рекомбинации генных сегментов. Предполагается, что этот переход также имел важное значение для регуляции экспрессии генов и осуществления механизмов клонального отбора антителопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответа.
Настоящая работа представляет собой часть проекта, направленного на изучение эволюции механизмов изотипического исключения генов легких цепей ИГ у низших позвоночных. Целями работы являлись изучение структуры и организации генов легких цепей ИГ стерляди (Acipenser ruthenus), представителя филогенетически древней группы костно-хрящевых рыб.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Иммуноглобулины выполняют в организме позвоночных функцию гуморальных антител и антиген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов. Особенностью этого класса белков является огромное разнообразие, позволяющее им вступать во взаимодействие с фактически любыми биологическими макромолекулами.
Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух идентичных легких (L) полипептидных цепей. H- и L-цепи построены из нескольких доменов, каждый из которых состоит примерно из 110 аминокислотных остатков. У млекопитающих существует пять классов H-цепей: g, m, a, d, и e. Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нескольких (трех или четырех) C-концевых доменов. N-концевые домены различаются в разных молекулах и называются вариабельными (V) доменами. C-концевые домены имеют одинаковую структуру у молекул одного класса и называются константными (С) доменами (рис. 1) (Пол, 1987).
Среди L-цепей млекопитающих различают два типа: лямбда и каппа. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного и одного константного доменов. В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-цепи (Roitt et al. , 1993). Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем, что V и C области кодируются разными генами (генными сегментами), физически разнесенными в зародышевой ДНК.
В формировании вариабельных доменов H-цепей участвуют три генных сегмента: вариабельный (V), D-сегмент (от англ. diversity- разнообразие) и J-сегмент (от англ. joining- соединяющий). С-области Н-цепей разных классов кодируются отдельными генами (Roitt et al. , 1993).
Рис. 1. Схема строения молекулы иммуноглобулина.
Типичная молекула иммуноглобулина содержит две идентичные легкие (L) и две идентичные тяжелые (H) цепи, связанные между собой ковалентно дисульфидными связями. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного (VL) и одного константного (СL) домена. Н-цепь состоит из одного VH и нескольких CН доменов. В формировании зрелого гена L-цепи участвуют три генных сегмента: V-сегмент и J-сегмент кодируют V-домен, C-сегмент кодирует константный домен. На поздних стадиях развития В-лимфоцита генные сегменты, кодирующие вариабельные домены, объединяются в различных сочетаниях, образуя матрицу для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al. , 1979; Durdik et al. , 1984).
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Различные виды млекопитающих имеют сходную схему организации и экспрессии генов ИГ. Одним из наиболее изученных в этом отношении видов является человек. Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируются генами, расположеными в разных локусах и на разных хромосомах. Каппа локус состоит из большого количества Vk генных сегментов, собраных в группы, пяти Jk и одного Сkсегмента... Такой тип организации называется сегментарным (рис. 2). Лямбда локус состоит из группы Vl сегментов, точное количество которых неизвестно, и семи пар Jl-Cl сегментов. Три из них (JCl4 - JCl6) являются псевдогенами (Hieter et al. , 1981; Roitt et al. , 1993). В процессе развития В-лимфоцита в кроветворных органах один из V сегментов соединяется с одним из J сегментов посредством сайтспецифической рекомбинации (Schatz et al. , 1992). В этот процесс вовлекаются специальные олигомерные последовательности: гепта- и нонамеры, фланкирующие с 3' стороны V сегмент и с 5' стороны J сегмент (рис. 3) (Aguilera et al. , 1987; Hesse et al. , 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов является конфигурация промежутков между гепта- и нонамерами, называемых спейсерами. С V и J генными сегментами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12 пн спейсеры соответственно, а с V и J сегментами каппа типа - 12 пн и 23 пн спейсеры (Durdik et al. , 1984; Stavnezer et al. , 1985).
л
Рис. 2. Схема строения лямбда и каппа локусов генов L-цепей ИГ человека. Лямбда локус содержит много Vl сегментов и семь пар близкорасположенных Jl-Cl. Три из них яляюся псевдогенами (Y). Каппа локус содержит много Vk пять Jk и один Ck генный сегмент (Hieter et al. , 1981; Roitt et al. , 1993). Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей, задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны VL сегмент и с 5’ стороны JL сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из VL сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из JL сегмента. Это делает возможным соединение VL и JLсегментов без нарушения рамки трансляции (Aguilera et al. , 1987; Hesse et al. , 1989).
Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной, тоесть не привела к появлению полноценного гена, то рекомбинация происходит в каппа локусе на гомологичной хромосоме. В случае повторной абортивной перестройки аналогично происходят перестройки в лямбда локусах. Если в клетке непродуктивно перестроились все четыре локуса, то она превращатся в 0-клетку и подвергается апоптозу. Если же перестройка одного из локусов привела к образованию функционального гена, то рекомбинация остальных локусов блокируется. Детали механизма блокирования неизвестны, однако установлено, что необходимым условием для него является транскрипция продуктивно перестроенного гена. В результате в каждом индивидуальном лимфоците синтезируется только один тип L-цепей, каппа или лямбда, и экспрессия гена происходит только на одной из двух гомологичных хромосом. Эти феномены, называемые изотипическим и аллельным исключениями лежат в основе ключевого принципа функционирования иммунной системы - принципа клональной селекции (Пол, 1987; Strob, 1987).
В организме млекопитающих генерируется свыше десяти миллионов вариантов антител, хотя в геноме содержится значительно меньшее количество генных сегментов, которые могут участвовать в формировании вариабельных доменов. В случае L-цепей, основным источником разнообразия является комбинативное сочетание V и J сегментов. Дополнительным источником является смещение рекомбинационной рамки в месте их соединения. Кроме того, V генные сегменты могут обмениваться участками ДНК с псевдогенами посредством генной конверсии. Очень существенный вклад в разнообразие специфичностей антител вносит соматическое мутирование вариабельных генных сегментов в сайтах, участвующих в формировании антигенсвязывающего центра. Соматическое разнообразие генерируется при вторичном иммунном ответе путем включения гипермутационного механизма в клетках памяти в зародышевых центрах лимфатических узлов (Tonegawa 1983; Roitt et al. , 1993).
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ ПОЗВОНОЧНЫХ
Хрящевые рыбы.
Гуморальный иммунный ответ в виде специфических антител обнаруживается только у позвоночных. Наиболее примитивными видами, у которых обнаружена способность синтезировать ИГ, являются хрящевые рыбы. Представители трех основных таксонов (акулы, скаты и химеры) продуцируют антитела в ответ на введение широкого спектра антигенов. Однако, в отличие от млекопитающих, гетерогенность сывороточных антител у хрящевых рыб выражена очень слабо. Кроме того, у них не обнаружено созревание иммунного ответа - при вторичном введении антигена спектр антител не меняется (Flajnik, 1996). Результаты исследований последних лет продемонстрировали, что организация генов ИГ у хрящевых рыб также имеет ярко выраженные особенности.
У хрящевых рыб обнаружены гены трех типов L-цепей, локализующиеся в разных локусах. В каждом локусе геные сегменты организованы в кластеры, имеющие по одному V, J и C генному сегменту (рис. 4). Таких кластеров содержится несколько десятков или даже сотен в одном локусе на расстоянии 12-15 тпн друг от друга (Rast et al. , 1994).
Гены первого типа найдены у разнозубой акулы (Heterodontus francisci) (Shamblott and Litman, 1989) и малого ската (Raja erinacea) (Anderson et al. , 1995). У акулы кластеры имеют размер 3-6 тпн. V и J, J и C генные сегменты разделены примерно 0, 5 и 4 тпн соответственно. У ската V и J сегменты слиты в зародышевой ДНК.
Гены второго типа обнаружены у пятнистой химеры (Hydrolagus colliei) (Maisey, 1984), песчаной акулы (Carcharhinus plumbeus) (Hohman et al. , 1992; Hohman et al. , 1993), разнозубой акулы и малого ската (У всех изученных видов в кластерах этого типа V и J генные сегменты соединены уже в зародышевом геноме. V и C гeнные сегменты разделены 2-3 тпн.
Рис. 4. Схема строения локусов генов L-цепей ИГ у акулы.
Организация генов у акулы имеет кластерный тип. Каждый кластер имеет размер 3 6 тпн и содержит по одному VL, JL и CL генному сегменту.
Обнаружено три типа генов L-цепей ИГ. Локусы генов первого и третьего типов имеют схожую организацию. В этом случае VL и JL, JL и CLсегменты разделены примерно 0, 5 и 4 тпн соответственно (А) (Rast et al. , 1994).
В локусе генов второго типа VL и JL сегменты соединены уже в зародышевом геноме (Б).
Третий тип генов L-цепей найден у акулы-няньки (Gynglimostoma cirratum) (Greenberg et al. , 1993) и разнозубой акулы (Rast et al. , 1994). В кластерах этого типа V и J, J и C генные сегменты разделены, как и в кластерах первого типа, примерно 0, 5 и 4 тпн соответственно. V и J генные сегменты фланкируются сайтами специфической рекомбинации со спейсерами 12 и 23 пн, что соответствует конфигурации спейсеров в локусах каппа типа млекопитающих. По первичной структуре гены третьего типа тоже наиболее близки к генам каппа типа высших позвоночных (гомология по аминокислотной последовательности составляет около 60%).
Гены этих трех типов имеют между собой низкую степень гомологии: 40-50% по нуклеотидной последовательности С сегментов и 50-60% по последовательности V сегментов (Hohman et al. , 1993).
Полученные данные показывают, что у хрящевых рыб имеется очень большое количество генных сегментов. Однако специфика организации генов исключает комбинативное сочетание сегментов. Все разнообразие антител у хрящевых рыб формируется только за счет экспрессии большого количества кластеров. Данные о нуклеотидных последовательностях из разных локусов выявили низкую гетерогенность генов (85-95%), что указывает на отсутствие соматического мутагенеза (Rast et al. , 1994).
Костистые рыбы.
Анализ сывороточных антител пещерного сомика (Ictalurus punctatus) показал наличие трех типов L-цепей с различными молекулярными массами: 26, 24 и 22 кДа. Два вида антител мыши, 3F12 и 1G7, захватывают более 90% от общего количества иммуноглобулинов в реакции иммунопреципитации. При этом 3F12 антитела связываются с молекулами, содержащими L-цепи массой 24 и 22 кДа, а 1G3 антитела с другой субпопуляцией, содержащей L-цепи массой 26 кДа. На основе этих данных L-цепи разделяют на два класса, называемые F и G (Lobb et al. ,1984).
Геномная организация локуса L-цепей G типа имеет кластерный тип (рис. 5). В каждом кластере содержится по одному J и C сегменту и два V сегмена. Вариабельные генные сегменты расположены всегда в противоположной транскрипционной полярности к J и C сегментам . В ряде геномных клонов один V сегмент располагался с 3' стороны от C генного сегмента. Размер кластера равен примерно 3 тпн, расстояние между кластерами около 6 тпн (Ghaffari and Lobb, 1993; Bengten, 1994).
