10 мМ Na2ЭДТА,
10 мМ NaCl.
Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы, при 37оС в течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) два раза и проводили диализ при 10оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ Na2ЭДТА, рН 7, 5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др. , 1984).
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Выделение поли(A)+РНК.
Для ингибирования РНКазы все растворы, не содержащие трис, обрабатывали 0, 1% диэтилпирокарбонатом 12 часов при 37оС и автоклавировали. Посуду прокаливали при 250оС в течение 4 часов. Поли(A)+РНК выделяли из суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго(dT)-целлюлозе. Для этого РНК растворяли в воде, прогревали при 65оС в течение 5 мин, добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис-HCl, рН 7, 6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЭДТА, 0, 2% SDS) и трижды пропускали через колонку с олиго(dT)-целлюлозой. Затем промывали колонку 5-10 объемами буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера, содержащего 0, 1 М NaCl. После этого элюировали поли(A)+РНК в 2-3 объемах воды, обработанной диэтилпирокарбонатом, добавляли 2, 2 объема этанола и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g при 4оС (Маниатис и др. , 1984). Синтез кДНК.
Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene. По матрице поли(A)+РНК синтезировали первую цепь кДНК (рис. 9).
Реакционная имела состав:
5 мкл 10-кратного буфера для синтеза первой цепи,
3 мкл смеси метил-dНTФ,
2 мкл раствора праймер-линкера (1. 4 мкг/мкл),
1 мкл ингибитора РНКазной активности,
1. 5 мкл фермента обратная транскриптаза (50 е. а. /мкл),
вода до суммарного объема 50 мкл.
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1 часа. Затем охлаждали до 0оС и добляли компоненты для синтеза второй цепи кДНК: 20 мкл буфера для синтеза второй цепи,
6 мкл смеси dНTФ,
88, 9 мкл стерильной воды,
2 мкл 32Р-dНTФ (800 Ки/мМ),
2 мкл раствора РНКазыH (1. 5 е. а. /мкл),
11. 1 мкл ДНК полимеразы I.
Смесь инкубировали при 16оС в течение 2, 5 часов, затем охлаждали до 0оС и добавляли компоненты для застройки “липких” концов: 23 мкл смеси дНTФ,
2 мкл Pfu ДНК полимеразы (2, 5 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 72оС в течение 30 мин.
Затем проводили экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) и равным объемом хлороформа, после чего отбирали водную фазу, добавляли 20 мкл 3М NaAc и 400 мкл 96% этанола и осаждали кДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин.
Сшивка молекул кДНК с вектором.
кДНК растворяли с EcoR I адапторами (рис. 9) и инкубировали при 4оС в течение 30 мин. Затем добавляли компоненты для сшивки молекул адапторов и молеул кДНК:
праймер-линкер
5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT 3'
3' AAAAAAAAAAAA 5'
поли(A)+РНК
Xho I сайт 1-я цепь EcoR I адаптор
5' р-TCGAGTTTTTTTTTTTT, ,, ,, ,, ,CTCGTGCCG-р 3'
3' р-CAAAAAAAAAAAA GAGCACGGCTTAA-р 5'
2-я цепь
Xho I сайт кДНК EcoR I сайт
5' CTCGAGTTTTTTT, ,, ,, ,, ,, CTCGTGCCGAATTC 3’
3' GAGCTCAAAAAAA GAGCACGGCTTAAG 5’
ДНК вектора ДНК вектора
Рис. 9. Схема синтеза кДНК по матрице поли(A)+РНК и сшивки с плазмидным вектором pBluescript KS(+) по сайтам EcoR I и Xho I.
Обозначения: ,, ,, , - метилированная цепь кДНК, -неметилированная цепь кДНК.
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
1 мкл 10 мМ рATФ,
1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т4 (4 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего инактивировали лигазу прогреванием при 70оС в течение 30 мин, охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для фосфорилирования концевых нуклеотидов:
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
2 мкл 10 мМ рATФ,
6 мкл стерильной воды,
1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т4 (10 е. а. /мкл). Реакционную смесь инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для образования липких концов по сайту рестрикции эндонуклеазы Xho I:
28 мкл буфера 4,
3 мкл Xho I (40 е. а. /мкл).
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1, 5 часа. Затем добавляли 5 мкл 10-кратного буфера STE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 100 мМ Na2ЭДТА) и пропускали через колонку с гелем сефакрил С-500. Фракции, содержащие молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1: 1) и равным объемом хлороформа. Затем добавляли двойной объем этанола, осаждали кДНК центрифугированием, промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Для лигирования брали 5 мкл раствора кДНК (600 нг) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1 мкг), имеющего "липкие" дефосфорилированные концы по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR I и Xho I (рис. 9).
Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора рATФ и 1 мкл фермента лигазы фага Т4 (4 е. а. /мкл). Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего экстрагировали равными обьемами фенол-хлороформа и хлороформа.
Амплификация библиотеки.
Электротрансформацию проводили как описано в п. Трансформация прокариотических клеток, после чего высевали 1/1000 объема (2, 5 мкл) среды SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг/мл) для определения количества трансформированных клеток. Остальную часть помещали в 100 мл среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и инкубировали при 37оС при перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет величины D550=2-2, 5. Затем отбирали 1, 6х1011клеток, осаждали их центрифугированием, суспендировали в 4 мл среды LB и перемешивали с 4 мл глицерина. Полученную библиотеку хранили при -70оС.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) содержала следующие компоненты:
100 нг ДНК матрицы,
100 нг невырожденного праймера,
500 нг вырожденного праймера,
5 мкл 2 мМ раствора дНTФ,
5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8, 8, 50 мМ KCl, 1, 5 мМ MgCl2, 0, 001% желатин), 1 мкл Taq полимеразы,
вода до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995). Температурный режим ПЦР.
Реакционную смесь инкубировали при 95оС в течение 5 мин, после чего добавляли Taq полимеразу и использовали температурный режим, при котором в течение первых 18 циклов температуру отжига праймеров понижали на 3оС черех каждые три цикла:
1й-18й циклы 95оС - 1 мин (денатурация ДНК),
50-35оС - 1 мин (отжиг праймеров),
72оС - 2 мин (полимеризация).
19-й-30-й циклы: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 2 мин.
31-й цикл: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 10 мин.
СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК
Фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, разделяли в 1% агарозном геле и выделяли как описано в п. Выделение ДНК из геля. Затем осаждали ДНК этанолом, растворяли в 5-10 мкл воды и добавляли компоненты для удаления выступающих нуклеотидов с 3' конца ДНК: 1 мкл 10-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 8, 2, 100 мМ KСl, 60 мМ (NH4)2SO4, 20 мМ MgCl2, 1% тритон Х-100 и 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин), 1 мкл 10 мМ dНTФ,
1 мкл Pfu ДНК полимеразы (2, 5 е. а. /мкл),
воду до конечного объема 10 мкл.
Смесь инкубировали 30 мин при 72оС после чего охлаждали до 0оС и добавляли компоненты для сшивки с вектором pBluescript KS(+) по сайту рестрикции Sma I:
1 мкл расщепленного вектора (0, 5 мкг),
1 мкл 10-кратного буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 7 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ), 1 мкл 10 мМ дATФ,
1 мкл ДНК лигазы фага Т4 и воду до конечного объема 10 мкл. Смесь инкубировали одни сутки при комнатной температуре и затем использовали для химической трансформации клетокE. coli. Трансформированные клетки высевали на селективную среду: 1, 5% LB-агар с ампициллином (50 мкг/мл), тетрациклином (15 мкг/мл), ИПТГ (2 мМ), X-Gal (500 мкг/мл) и инкубировали 14 часов при 37оС. После этого отбирали колонии белого цвета (Маниатис и др. , 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).
СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Библиотеку кДНК высевали на чашки Петри с 1, 5% LB-агаром с ампициллином (50 мкг/мл) из расчета 4000 колоний на чашку и инкубировали при 37оС до тех пор пока колонии не достигнут 0, 5-1 мм в диаметре. Колонии переносили на нейлоновую мембрану и инкубировали при комнатной температуре в денатурирующем растворе (0, 5 М NaOH, 1, 5 М NaCl) в течение 7 мин и два раза по 2 мин в нейтрализующем растворе (1, 5 М NaCl, 0, 5 М трис-HCl, рН 7, 5). Затем споласкивали мембрану в 2-кратном буфере SSC (0, 3 М NaCl, 0, 03 М цитрат натрия), высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм. После этого мембрану помещали в 50 мл предгибридизационного раствора (раствор 1), содержащего:
6-кратный SSC (0. 9 М NaCl, 0, 09 М цитрат натрия),
5-кратный раствор Денхардта (0, 1% бычий сывороточный альбумин, 0, 1% фикол, 0, 1% поливинилпиролидон),
0, 5% SDS,
10% декстран сульфат,
500 мкг денатурирированной ДНК цыпленка,
и инкубировали 1 час при 55оС. После этого добавляли меченую 32P-дATФ ДНК зонда и инкубировали 12-18 часов при 55оС при постоянном покачивании. После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в 200 мл 2-кратного SSC + 0, 1% SDS при комнатной температуре, 15 мин в 1-кратном SSC + 0, 1% SDS% при 55оС и два раза по 10 мин в 0, 1-кратном SSC + 0, 1% SDS при 55оС. Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70оС с рентгеновской пленкой (Маниатис и др. , 1984).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера (Sanger et al. , 1977). 5 мкг плазмидной ДНК, очищеной гель-фильтрацией на колонке с биогелем П-10, денатурировали в 50 мкл 0. 2 М NaOH при 37оС в течение 30 мин, затем добавляли 5 мкл 3 М NaAc, рН 5, 1, двойной объем этанола и инкубировали 30 мин при температуре -70оС. После этого осаждали ДНК центрифугированием при 12000 g в течение 12 мин и промывали осадок 100 мкл 80% этанола. Осадок ДНК высушивали при комнатной температуре и растворяли в 7, 5 мкл воды, добавляли 2 мкл 5-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 100 мМ MgCl2, 250 мМ NaCl), 0, 5 мкл праймера (50 нг) и инкубировали 30 мин при 37оС. После этого пробирку помещали в лед и добавляли 1 мкл 0, 1 М ДТТ, 2 мкл 1, 5 мкМ дНTФ без дATФ, 0, 5 мкл раствора35S-дATФ и 2 мкл ДНК полимеразы фага Т7 (2, 5 е. а. /мкл). Затем инкубировали 3 мин при 20оС и сразу отбирали по 3, 5 мкл в четыре пробирки, каждая из которых содержала по 2, 5 мкл 80 мкМ смеси четырех дНTФ, 50 мМ NaCl и 8 мкМ одного из ддНTФ. Инкубировали 5 мин при 37оС и добавляли по 4 мкл стоп-раствора (95% формамид, 20 мМ Na2ЭДТА, 0, 05% бромфеноловый синий, 0, 05% ксилен цианол). Полученные образцы инкубировали 3 мин при 100оС, быстро охлаждали до 0оС и отбирали по 2 мкл для электрофореза в денатурирующем полиакриламидном геле, имеющем состав:
6% акриламид,
8 М мочевина,
1-кратный глицерин-толерантный буфер (1, 1% трис, 0, 36% таурин, 0, 02% Na2ЭДТА). Электрофорез проводили при напряжении 40 В/см. Затем гель выдерживали 30 мин в 10% уксксной кислоте, высушивали и экспонировали 12 часов при комнатной температуре с рентгеновской пленкой (Маниатис и др. , 1984).
САУЗЕРН БЛОТ ГИБРИДИЗАЦИЯ
10 мкг геномной ДНК, выделенной из печени стерляди, инкубировали в течение 2 часов с эндонуклеазами рестрикцииPst I и Pvu II (по 50 е. а. ) при 37оС в буфере, содержащем 100 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7, 5, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл бычий сывороточный альбумин, 6 мМ 2-меркаптоэтанол. Затем экстрагировали ДНК последовательно равными объемами фенол-хлороформа (1: 1) и хлороформа, осаждали ДНК двумя объемами этанола, растворяли в воде и наносили на 1% агарозный гель. Электрофорез проводили при напряжении 1 В/см и температуре 12оС в течение 12 часов. Затем гель инкубировали при комнатной температуре 30 мин в 0, 25 М HCl, 30 мин в денатурирующем растворе (0, 5 М NaOH, 1, 5 M NaCl) и 10-15 мин в растворе 1 (0, 25 М NaOH, 1, 5 M NaCl). После этого ДНК переносили на нейлоновую мембрану методом вакуумного переноса в растворе 1. Мембрану споласкивали в 2-кратном SSC, высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм.
Предгибридизацию проводили при 55оС в течение 1 часа в растворе 1 (см. Скрининг библиотеки кДНК). Гибридизация длилась 12-16 часов при 55оС с концентрацией зонда не более 10 нг/мл. Отмывку проводили два раза по 10 мин в 2-кратном SSC + 0, 1% SDS при комнатной температуре и один раз 15 мин в 1-кратном SSC + 0, 1% SDS при 55оС. Экспонирование длилось 12 часов при -70оС (Маниатис и др. , 1984). РЕЗУЛЬТАТЫ
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ СКРИНИНГ
В качестве источника мРНК брали лейкоциты периферической крови стерляди. На основе этой мРНК синезировали кДНК. Полученные молекулы кДНК клонировали в плазмидном векторе pBluescript KS(+), после чего трансформировали этим вектором клеткиE. coli штамма XL-1 Blue MRF’. В результате этого была получена библиотека кДНК представительностью 6 миллионов клонов. Библиотеку амплифицировали до объема 5 х 1011 клеток. Cуммарную плазмидную ДНК библиотеки выделяли и использовали в ПЦР с парой праймеров, один из которых гомологичнен участку вектора вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и располагается в кодирующей ориентации. Второй праймер вырожденный, соответствующий наиболее консервативному участку последовательности J-сегментов L-цепей ИГ позвоночных в некодирующей ориентации (рис. 10).
Один из фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР, соответствовал ожидаемому размеру (370 пн). Этот фрагмент выделяли и субклонировали в векторе pBluescript KS(+). Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он гомологичен генам V области L-цепей ИГ (Рис. 11).
Этот фрагмент был использован в качестве зонда для скрининга библиотеки кДНК лейкоцитов стерляди. Скрининг 4000 колоний библиотеки кДНК в мягких условиях гибридизации позволил выявить пять клонов с размером вставки кДНК от 800 до 1050 пн. Для четкого разделения клонов проводили вторичный скрининг библиотеки кДНК, после чего выделенные клоны амплифицировали.
прамер Т3
5'-GCAATTAACCCTCACTAAAGG-3';
J-праймер
5'-A(G/C)(T/C)(T/C)TGGT(T/G/C)CCTTTTCC(A/G)AA-3’
Рис. 10. Схема ПЦР. Т3 праймер располагается вблизи сайта клонирования молекулы кДНК и комплиментарен некодирующей цепи, J-праймер гомологичен участку кодирующей цепи J-сегмента генов L-цепей ИГ позвоночных. Ожидаемая длина продуктов около 400 пн.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Определена нуклеотидная последовательность вставки кДНК клона В1. кДНК клона В1 размером 1050 пн представляла собой полноразмерную копию зрелого гена L-цепи ИГ и содержала 5’-нетранслируемую область, последовательность кодирующую лидерный пептид, V область, С область, а также 3’-нетранслируемую область (Рис. 11). На основе первичной структуры клона В1 сконструировали и синтезировали три праймера, соответствующих консервативным районам V и C области и использовали их для определения нуклеотидной последовательности клонов Е4 и С2. Последовательность клона Е4 была определена только в области, примыкающей к Т3 промотору вектора. За исключением 2 нуклеотидов она полностью идентична последовательности В1. Последовательность клона С2 имела химерный характер. В области Т3 промотора она содержала фрагмент соответствующий 3’части С сегмента клона B1 с заменами нескольких нуклеотидов. В то же время использование для определения последовательности праймеров V и C области показало, что эта вставка содержит дополнительно перестроенный ген легкой цепи, содержащий большую часть V сегмента и второй С сегмент, отличающийся от первого в одной позиции. Поскольку пока не удалось определить последовательность в области стыка этих двух фрагментов вставки, нельзя сказать, находятся ли они в одной или разных ориентациях. По-видимому, сходный химерный характер имеет последовательность клона D2 (данные не показаны).
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
Нуклеотидную и предсказанные аминокислотные последовательности клона В1 сравнивали с последовательностями V и C генов L-цепей ИГ других видов позвоночных (Рис 12). На аминокислотном уровне V область имеет наибольшее сходство с V-областями L-цепей класса F и G пещерного сомика и с V-областью L1 класса ИГ форели (63-71%). И те и другие относятся к каппа-типу L-цепей. При поиске гомологов в полном банке последовательностей ИГ млекопитающих первые 100 позиций с наибольшим сходством представляли собой также V каппа области. С-область клона В1 имеет на аминокислотном уровне приблизительно одинаковое и не очень значительное сходство с широким спектром С-областей L-цепей ИГ хрящевых и костистых рыб (41-44%). На нуклеотидном уровне наиболее близкими гомологами В1С гена являются гены III класса хрящевых рыб (65%).
АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ
Геномную организацию локуса генов L-цепей ИГ стерляди оценивали методом Саузерн блот гибридизации. Геномную ДНК выделяли из печени стерляди. ДНК расщепляли эндонуклеазами рестрикцииPst I и PvuII. После электрофоретического разделения и переноса фрагментов ДНК на нитроцеллюлозную мембрану проводили гибридизацию в мягких условиях. В качестве зонда на V-гены использовали фрагмент, полученный в результате ПЦР (см. Конструирование библиотеки кДНК и ее скрининг). В качестве С-зонда использовали участок кДНК клона В1, кодирующий CL сегмент, который вырезали по сайтам рестрикции эндонуклеазами EcoR V-Xho I. V-зонд выявлял более 20 гибридизующихся фрагментов ДНК, в то время как С-зонд гибридизовался только с 3-4 фрагментами (рис. 13).
5' нетранслируемая область |> лидерный пептид
1 15 30 45 60 75 90
